秦卓明 仉偉 劉霞 馬秀麗 黃兵 李玉峰 徐懷英

摘 要：山東某父母代肉種雞開產(chǎn)后死淘率突然升高，死亡雞肝臟、脾臟、腺胃等內(nèi)臟器官腫大，高峰期周產(chǎn)蛋率僅為72%，明顯低于同場區(qū)未發(fā)病雞群的83%，更顯著低于其標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)蛋率（87%）。利用RT-PCR技術(shù)對腫大的臟器分別進(jìn)行分子病原學(xué)診斷，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、戊型肝炎病毒和馬立克氏病毒等PCR檢測結(jié)果陰性，而ALV pol基因檢測陽性，經(jīng)測序與GenBank已發(fā)表的ALV E亞群毒株的核苷酸同源性高達(dá)97.5%～99.5%。血清學(xué)檢測證實(shí)， ALV-AB亞群在發(fā)病前陽性率為8.3%，而發(fā)病后的抗體陽性率則攀升為70%。雞群發(fā)病后的種蛋蛋清p27抗原檢測ALV陽性率為5.3%。綜上所述，雞群可能混合感染ALV。

關(guān)鍵詞：肉種雞；禽白血??；pol基因；混合感染

中圖分類號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1673-1085（2014）11-0006-05

禽白血?。ˋvian leucosis virus，ALV）是由反轉(zhuǎn)錄病毒科禽白血病/肉瘤病毒群病毒引起的禽類多種腫瘤性疾病的總稱，具有感染率高、發(fā)病率低等特點(diǎn)。它即可誘發(fā)產(chǎn)生腫瘤，造成雞只的死亡，又可產(chǎn)生非腫瘤綜合癥，導(dǎo)致雞群生長發(fā)育不良，影響生產(chǎn)性能[1-3]。禽白血病一般分為兩大類：一類為A、B、C、D和J亞群等外源性病毒，具有致病性；另一類為E亞群，屬內(nèi)源性病毒，主要以前病毒的形式存在，對雞幾乎不致病，但可以加重ALV其他亞群和其他病原的感染[4，5]。

2011年初至2012年11月以來，山東省十多個(gè)父母代肉種雞場發(fā)生大肝大脾病。臨床主要表現(xiàn)為：20周齡以后的雞，雞體消瘦、生長發(fā)育不良、產(chǎn)蛋下降、死淘率升高，缺乏產(chǎn)蛋高峰等。剖檢可見發(fā)病雞肝臟和脾臟腫大、腺胃腫大，個(gè)別雞出現(xiàn)卵黃性腹膜炎和腹腔有血凝塊等?？祻?fù)雞群多數(shù)產(chǎn)蛋達(dá)不到指標(biāo)，加之死淘增高，后代雛雞質(zhì)量差等，經(jīng)濟(jì)損失巨大?，F(xiàn)結(jié)合一個(gè)雞場的實(shí)例，進(jìn)行病原分析，以期找出針對性防控措施。

1 材料和方法

1.1 病料來源和病毒分離 病料來自山東某父母代肉種雞場，所采組織為死淘雞的可疑腫瘤病變組織，主要包括肝臟、脾臟、腺胃等。采集的腫瘤等病變組織，一部分進(jìn)行病原學(xué)分離和分子病原診斷；另一部分，利用10%福爾馬林固定，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.2 病毒分離和鑒定

1.2.1 病毒分離純化 將病變的腫瘤組織用生理鹽水勻漿，反復(fù)凍融3次，離心取上清，加雙抗10000U/ml過夜處理。將上述新鮮病料接種已長成單層的DF-1細(xì)胞，0.2ml/瓶，37℃孵育2h后棄掉病毒液，加入含1%胎牛血清的DMEM維持液。在37℃繼續(xù)培養(yǎng)7～9d后，將細(xì)胞反復(fù)凍融3次收獲，繼續(xù)傳代至2代病毒，-80℃保存。同時(shí)，利用IDEXX公司ALV p27抗原檢測試劑盒進(jìn)行檢測。

1.2.2 分子病原學(xué)鑒別診斷 根據(jù)ALVpol基因保守序列設(shè)計(jì)一對特異性引物，正向引物：5' ACTGCTGCCTTGGAACGATG3'；反向引物： 5' AAGCCGCCGCTGTAGACG 3'。將1.2.1中的病變組織處理液提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳分析。同時(shí)，參考已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)設(shè)計(jì)特異性引物如馬立克病毒（MDV）、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）、戊型肝炎病毒（HSS）等進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行分子鑒別診斷[6-8]。

1.3 雞群的跟蹤檢測

1.3.1 種蛋蛋清p27抗原檢測 收集該發(fā)病雞群所產(chǎn)種蛋92枚，用IDEXX公司ALV p27抗原試劑盒進(jìn)行檢測。

1.3.2 發(fā)病雞群發(fā)病前后的不同病原抗體變化 采集雞群發(fā)病前血清60份和發(fā)病后140份，按照IDEXX公司ALV-AB亞型和ALV-J亞型抗體檢測試驗(yàn)盒操作說明進(jìn)行檢測。

1.4 ALV plo基因核苷酸序列比較和系統(tǒng)進(jìn)化 將分離株的pol核苷酸序列與GenBank中已發(fā)表的ALV不同亞群序列利用DNAstar Lasergen6.0軟件進(jìn)行同源性分析，并利用Mega5.0依據(jù)核苷酸同源性繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 臨床發(fā)病概況 山東某父母代肉種雞場，品種為羅斯308。自22周齡開始，死淘率逐漸增高，31周齡達(dá)到高峰，最高周死淘率接近1%，隨后，死淘逐漸減少。臨床表現(xiàn)為：肉種雞雞體消瘦、精神萎靡不振，雞冠、肉髯蒼白，食欲減少，產(chǎn)蛋上升緩慢，缺乏產(chǎn)蛋高峰。表1顯示的是飼養(yǎng)在同一場區(qū)健康組和發(fā)病組24～34周齡生產(chǎn)指標(biāo)比較。在生產(chǎn)性能方面，發(fā)病組群雞最高周產(chǎn)蛋率僅為72%，遠(yuǎn)低于該品種標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)性能的87%，同時(shí)也低于同場飼養(yǎng)的未發(fā)病健康組雞群（高峰周產(chǎn)蛋率為83%）。

2.2 臨床剖檢特點(diǎn) 死亡雞群通常十分消瘦，雞冠蒼白，伴有拉稀癥狀。剖檢可見肝脾腫大，色澤多樣，質(zhì)度不等（圖1A和F）；有的肝臟表面有白色結(jié)節(jié)（圖1D和E）；有的脾臟表面有白色小點(diǎn)（圖1C）；膽囊充盈；腺胃腫大質(zhì)硬，腺胃乳頭糜爛（圖1B）。卵泡變性，卵泡膜未見出血，少數(shù)雞卵巢萎縮；卵黃性腹膜炎多見，腹腔內(nèi)存在肝破裂血凝塊。健康組盡管也有死淘雞，但大多以卵黃性腹膜炎為主要癥狀，未見內(nèi)臟器官腫大等病癥。

圖2顯示的是腫瘤在發(fā)病組死淘雞中所占的比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在死淘雞的病理剖檢中，發(fā)生腫瘤的比例基本維持在40%～60%，平均為49.6%。而健康未發(fā)病組卻不存在這種現(xiàn)象。由此推測，腫瘤是雞群死淘率較高和生產(chǎn)性能差的重要原因。

病理組織HE染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)：從肝臟中可見大量增生的髓細(xì)胞瘤細(xì)胞，且大量聚集，呈結(jié)節(jié)灶性分布，主要見于血管周圍，有的呈彌漫性浸潤，細(xì)胞核較大，較疏散。脾臟中亦可見淋巴細(xì)胞彌散性分布，紅髓血竇。此外，腺胃中的淋巴細(xì)胞則呈彌散性分布。

2.3 ALV p27抗原檢測和抗體跟蹤 由表2可知：發(fā)病后32周齡雞群的92個(gè)種蛋，其ALV p27抗原陽性率為5.4%（5/92）?？贵w檢測表明：發(fā)病前后ALV-J檢測均為陰性，而ALV-AB抗體陽性率發(fā)病前為8.3%（5/60），發(fā)病后攀升為70%（98/140），但未分到ALV A/B亞群病毒。

2.4 ALV病原分離 RT-PCR特異性ALV診斷表明，腫瘤樣品可擴(kuò)增到大小為662bp的目的條帶，ALV檢測結(jié)果為陽性（圖3），經(jīng)測序分析為ALV，命名為SDBD 2012。陽性樣品接種DF1細(xì)胞進(jìn)行病毒分離。從感染SDBD 2012的DF-1細(xì)胞中提取前基因組DNA，PCR擴(kuò)增env基因中的gp85基因，未擴(kuò)增出目的條帶。

2.5 ALV pol核苷酸同源性比較及其遺傳進(jìn)化關(guān)系分析 SDBD 2012株的pol基因經(jīng)測序?yàn)?72bp。與GenBank中已發(fā)表的雞的17個(gè)不同亞群ALV的參考株核苷酸同源性比較表明，該毒株與YG6100、E-B9等國際較早發(fā)現(xiàn)的ALV內(nèi)源性E亞群代表株的核苷酸同源性高達(dá)99.5%，與2env、1/2env等 美國ALV E亞群經(jīng)典代表株的核苷酸同源性也較高，為99%。而與國內(nèi)1997-2009年流行的常見J亞群代表株同源性僅為97.5%～98%（詳見圖4）。

根據(jù)Mega5.0，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5），分析不同毒株之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果顯示，該分離株與E亞群代表株親緣關(guān)系較近。

3 討論

3.1 病原學(xué)和血清學(xué)跟蹤調(diào)查 對發(fā)病雞群所產(chǎn)的種蛋進(jìn)行檢測，蛋清ALV p27抗原陽性率為5.3%，證實(shí)有ALV感染。利用ALV A/B亞群ELISA抗體試劑盒檢測發(fā)病前后雞群的抗體，A/B亞群的陽性率由8.3%攀升到70%，從血清學(xué)角度證實(shí)可能有A/B亞型ALV感染，但未分離病毒。我國白羽肉雞的種源全部來自國外，J亞型ALV十分普遍[9，10]，但在多個(gè)流行大肝大脾的肉種雞場，J亞群ALV抗體檢測在發(fā)病前后大都為陰性，反應(yīng)出此次流行的雞大肝大脾病可以完全排除J亞群ALV的混感。

3.2 ALV E亞群感染 本實(shí)驗(yàn)盡管通過RT-PCR技術(shù)證實(shí)了ALV的存在，系統(tǒng)進(jìn)化分析證實(shí)分離株與E亞群ALV遺傳距離較近。由于未分到ALV病毒，尚不能克隆gp85基因的序列（型決定基因），因此，不能從病原學(xué)的角度肯定E亞群ALV的存在。是否存在E亞群ALV的混合感染值得商榷？但已有大量的證據(jù)顯示，E亞群ALV的存在肯定會(huì)增強(qiáng)A/B亞群的協(xié)同感染[2，4]。至于這些基因片段是來自游離的E亞群ALV，還是來自細(xì)胞染色體上固有的序列，尚需要更深入的工作。

3.3 戊型肝炎 此次雞群發(fā)生的雞大肝大脾病癥在臨床發(fā)病、病理剖檢和組織病理學(xué)等方面，與戊型肝炎（Hepatitis spleonomegaly synarones， HSS）所導(dǎo)致的病癥十分相似。淋巴樣細(xì)胞浸潤是本次雞群發(fā)病的主要組織病理學(xué)特征，而該特征也是戊型肝炎的特征性病變之一。值得一提的是：上述病理變化與ALV的A/B亞群很難區(qū)分，二者均為淋巴細(xì)胞瘤，而與J亞群ALV不同，后者主要是骨髓樣細(xì)胞瘤。因此，盡管戊型肝炎R(shí)T-PCR和病原分離均未成功，但并不排除戊型肝炎混合感染的可能性。

3.4 協(xié)同感染 大肝大脾病的發(fā)生原因比較復(fù)雜，很可能是多因素的疊加或是長期的積累。由于單一因素的感染所致的損失相對較輕，而多因素混合作用則會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。本研究對容易產(chǎn)生腫瘤的網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥、馬立克和戊型肝炎等進(jìn)行了檢測，RT-PCR均未檢測到病毒核酸。但是，這不等于說在病理剖檢和組織學(xué)病變方面可完全排除戊型肝炎等感染的可能性。由于致腫瘤性病病毒分離培養(yǎng)極為困難，耗時(shí)長，成本高，因此，綜合目前臨床發(fā)病情況和實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果，混合疊加感染的可能性是最大的。

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