趙瑞麗等

摘 要 鋅指蛋白在調(diào)控植物防御和抗性方面具有重要作用。根據(jù)從小白菜中獲得的與銅脅迫相關(guān)的RING鋅指蛋白基因TDF片段設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用RACE技術(shù)克隆出具有完整閱讀框的小白菜RING鋅指蛋白基因，該基因全長(zhǎng)855 bp，開(kāi)放閱讀框606 bp，編碼202個(gè)氨基酸，分子量為21.32 ku，理論等電點(diǎn)為6.87，屬于中性蛋白。結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，該蛋白C-端含有1個(gè)保守的C3HC4型RING鋅指結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，小白菜RING鋅指蛋白與蕪菁RING鋅指蛋白的相似度高達(dá)98%，屬于C3HC4型RING鋅指亞家族。RT-PCR分析結(jié)果表明，在銅脅迫下該基因下調(diào)表達(dá)，推測(cè)其可能參與對(duì)銅脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。此結(jié)果為進(jìn)一步研究該基因在小白菜逆境應(yīng)答中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 小白菜；RING鋅指蛋白基因；RACE；RT-PCR

中圖分類號(hào) S634.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Cloning and Expression Pattern of a RING Zinc Finger

Protein Gene in Brassica chinensis L.

ZHAO Ruili， ZHONG Fenglin*， LIN Junfang， GAO Shichao，

HU Haifei， YANG Biyun， LIN Yizhang*

College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University Fuzhou， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract Zinc finger protein plays a key role in the regulation expression of plant defense and response. The primers were designed according to the transcript derived fragments. The 855 bp full length cDNA of RING zinc-finger gene was isolated by rapid amplification of cDNA ends（RACE）， including a 606 bp open reading frame encoding 202 amino acid residues. The molecular weight of deduced protein is 21.32 ku with a theoretical pI of 6.87. The protein has a C3HC4-type RING finger domain and blongs to C3HC4-type Zinc-finger subfamily. Phylogenetic analysis showed that RING zinc-finger gene had 98% similarity with Brassica rapa. Real-time PCR revealed that the expression of RING zinc-finger gene was down-regulated in copper stress， suggesting that it might response to copper stresses. The results would be useful in the study of its functions and mechanism in copper stress responses of Brassica chinensis L.

Key words Brassica chinensis L；RING zinc finger protein； RACE；RT-PCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.015

小白菜（Brassica Chinensis L）是十字花科蕓薹屬植物，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，栽培面積較廣，是備受人們喜愛(ài)的蔬菜之一。近年來(lái)，隨著含銅農(nóng)藥、化肥的使用，土壤中銅含量越來(lái)越高，嚴(yán)重影響了小白菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。

RING鋅指蛋白（RING zinc finger protein）是一類能夠與2個(gè)Zn2+結(jié)合形成穩(wěn)定的“指狀”結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)第5個(gè)保守區(qū)氨基酸的不同（Cys/His）， RING鋅指蛋白可分為RING-HC（C3HC4）和RING-H2（C3H2C3）2種類型[1]。RING鋅指蛋白在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育和增強(qiáng)植物抗逆性等過(guò)程中起著重要作用[2-4]。許多研究結(jié)果表明，RING鋅指蛋白能夠通過(guò)降解花粉管RNA、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)控光形態(tài)建成、染色質(zhì)重組等多種途徑參與生理調(diào)節(jié)過(guò)程[5-9]。在非生物脅迫方面，干旱、低溫、高溫、高鹽、ABA、GA等均能不同程度的調(diào)控植物RING鋅指蛋白的表達(dá)[10-14]。目前，對(duì)RING鋅指蛋白的研究多集中在擬南芥、水稻、矮牽牛、大豆等幾種植物中，關(guān)于小白菜RING鋅指蛋白對(duì)銅脅迫的響應(yīng)未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，10 mg/L銅濃度對(duì)小白菜形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)均有明顯的傷害作用，cDNA-AFLP（cDNA amplified fragment length polymorphism）技術(shù)分析此濃度銅脅迫下小白菜基因的差異表達(dá)，得到了與小白菜銅脅迫相關(guān)的RING鋅指蛋白基因TDF片段[15-18]。為闡述小白菜RING鋅指蛋白在銅脅迫下的表達(dá)，本研究在cDNA-AFLP技術(shù)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用RACE技術(shù)獲得該基因的cDNA全長(zhǎng)，并進(jìn)一步研究該基因在銅脅迫下的表達(dá)變化，為研究小白菜響應(yīng)銅脅迫分子機(jī)制及進(jìn)一步開(kāi)展抗逆遺傳改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本試驗(yàn)供試小白菜品種為上海青，試驗(yàn)于2012年7～9月在福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院設(shè)施實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、MseⅠ購(gòu)自Fermentas公司，Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，6%聚丙烯酰胺購(gòu)自Solarbio公司，RevertAit First strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購(gòu)自Thermo公司，SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒購(gòu)自Clontech公司，pMD-18T Vector、E. coll DH5ɑ competent cells、SYBRR Premix Ex TaqTM試劑盒購(gòu)自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 將種子播于珍珠巖和草炭土按3 ∶ 18的比例混勻的穴盤(pán)中，待幼苗長(zhǎng)到4～5片真葉時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗用清水洗去根部基質(zhì)，然后用泡沫板固定至培養(yǎng)液中培養(yǎng)。培養(yǎng)液配制參考葉菜類營(yíng)養(yǎng)液的標(biāo)準(zhǔn)配方[19]，其中Cu2+含量為10 mg/L。培養(yǎng)液每隔5 d更換1次，每次更換前取樣。水培至0、5、10、15、20 d時(shí)采集第5片真葉（去除主葉脈），再用液氮充分冷凍后置于-80 ℃冰箱保存用于RNA提取。

1.2.2 小白菜總RNA提取與cDNA的合成 小白菜總RNA的提取參考Trizol試劑說(shuō)明書(shū)，取1 μg的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。cDNA第一鏈的合成參考Thermo公司的RevertAit First strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，合成3′RACE模板cDNA的引物為錨定引物；5′RACESMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。cDNA第二鏈的合成采用LD-PCR法進(jìn)行，雙鏈cDNA用紫外分光光度法檢測(cè)。

1.2.3 cDNA-AFLP分析 cDNA-AFLP分析參照張鳳云[20]的論文進(jìn)行。取1 μL限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和MseⅠ對(duì)純化后的cDNA進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物可直接與已制備好的接頭EcoRⅠ和MseⅠ16 ℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物直接用于預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋至10 ng/μL進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，然后用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離差異條帶。將差異表達(dá)TDFs（Transcript Derived Fragments）進(jìn)行回收、二次PCR后經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、驗(yàn)證后送上海博尚公司測(cè)序。測(cè)序后的TDFs核苷酸序列于NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，預(yù)測(cè)其功能，篩選出與銅脅迫相關(guān)的基因。

1.2.4 基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增及測(cè)序 差異表達(dá)TDFs功能分析發(fā)現(xiàn)1個(gè)與RING鋅指蛋白相關(guān)的TDF片段。根據(jù)獲得的TDF片段設(shè)計(jì)3′RACE和5′RACE引物（表1）進(jìn)行嵌套PCR擴(kuò)增，第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍作為第2輪的模板。將所獲得的目的片段回收、純化后送到上海博尚公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN軟件將5′RACE、3′RACE序列與TDF片段拼接成RING鋅指蛋白的cDNA全長(zhǎng)序列。在全長(zhǎng)序列的3′UTR和5′UTR處設(shè)計(jì)特異引物RHZ-F、RHZ-R，克隆RING鋅指蛋白基因的ORF，并進(jìn)行序列校正。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 利用相關(guān)軟件分析RING鋅指蛋白的氨基酸序列：用BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行同源序列搜索，選取擬南芥、蒺藜苜蓿、蕪菁、葡萄、大豆、鷹嘴豆、西紅柿、黃瓜等同源性較高的鋅指蛋白應(yīng)用DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)；用MEGA5.2軟件中的NJ法完成進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)RING鋅指蛋白基本的理化性質(zhì)；用ProScal（http：//web.expasy.org/protscale/）默認(rèn)算法（Hphob./Kyte&Doolittle）預(yù)測(cè)該蛋白的疏水性，用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)， SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)信號(hào)肽， 應(yīng)用SOP-MA（http：// npsa-pbil.ibcp.fr/ cgi-bin/npsa_automat. pl）、 ProtScale（http：//www.expasy.ch/tools/protscale/）預(yù)測(cè)其編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域， 用NCBI的Conserved Domains程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/）對(duì)該基因編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行保守區(qū)分析。

1.2.6 基因表達(dá)特性分析 將不同脅迫處理的RNA樣品用SuperscriptTMШ First-Strand cDNA Synthesis System for RT-PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋10倍后作為RT-PCR的模板。根據(jù)已獲得的RING鋅指蛋白基因全長(zhǎng)設(shè)計(jì)特異性引物RHZrt-F和RHZrt-R，以小白菜Actin基因的actin-F和actin-R為內(nèi)參引物。實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）的具體步驟參考大連寶生物工程有限公司的SYBR Premix ExTaq試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 小白菜銅脅迫cDNA-AFLP分析

對(duì)篩選出的多態(tài)性較好的135對(duì)引物組合進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，共篩選出180條差異表達(dá)TDFs，挑選差異較為明顯的152條TDFs進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增、回收、測(cè)序，最終得到151條有效序列。將獲得的151條TDFs進(jìn)行功能分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1個(gè)與小白菜RING鋅指蛋白相關(guān)的TDF，其表達(dá)量在銅脅迫后顯著降低（圖1）。測(cè)序結(jié)果表明，該TDF長(zhǎng)度為267 bp（圖2）。Blast分析結(jié)果表明，該片段與蕪菁RING鋅指蛋白的相似度高達(dá)98%，推測(cè)其可能是小白菜RING鋅指蛋白cDNA上的1個(gè)片段。

2.2 RING鋅指蛋白基因的克隆及序列分析

由圖3可知，利用RACE技術(shù)獲得524 bp的5′序列和328 bp的3′序列，將3′、5′序列與cDNA-AFLP技術(shù)獲得的267 bp的TDF片段拼接后得到855 bp的RING鋅指蛋白cDNA全長(zhǎng)（GenBank accession： KF305521）。該序列包含1個(gè)長(zhǎng)度為606 bp的開(kāi)放閱讀框，72 bp的5′UTR和177 bp的3′UTR序列，23 bp的Poly A，推測(cè)其編碼202個(gè)氨基酸，含有起始密碼子ATG和終止密碼子TGA。特異引物RHZ-F、RHZ-R克隆ORF測(cè)序結(jié)果與拼接后的序列相一致。

2.3 RING鋅指蛋白的生物信息學(xué)分析

用ProtParam軟件預(yù)測(cè)，該基因編碼的蛋白分子量為21.3 ku，理論等電點(diǎn)為6.87，理論推導(dǎo)半衰期為30 h，消光系數(shù)為13 115，不穩(wěn)定指數(shù)為78.01，屬于不穩(wěn)定蛋白（參數(shù)大于40為不穩(wěn)定蛋白）。該蛋白N-端33～55位氨基酸具有較強(qiáng)的疏水性，組成疏水跨膜α-螺旋，第1～32位氨基酸暴露于膜外，第56～202位氨基酸位于膜內(nèi)，但N-端不存在肽酶切位點(diǎn)，不具備信號(hào)肽功能。

蛋白亞細(xì)胞定位是研究蛋白質(zhì)功能很重要的方面，PSOT Prediction亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，RING鋅指蛋白定位于線粒體內(nèi)膜的可信度為0.8，定位于葉綠體類囊體膜的可信度為0.7，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的可信度為0.6，定位于線粒體膜間隙的可信度為0.225，由此可知，RING鋅指蛋白定位于細(xì)胞內(nèi)膜的可能性最大。

應(yīng)用SOPMA預(yù)測(cè)其編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明該蛋白以α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，分別為37.62%和45.05%；延伸鏈和β轉(zhuǎn)角較少，分別為13.37%和3.96%。

用ScanProsite在線軟件進(jìn)行功能區(qū)分析，并用NCBI的Conserved Domains程序?qū)υ摶蚓幋a蛋白質(zhì)進(jìn)行保守區(qū)分析，結(jié)果顯示該蛋白C-端113～159位氨基酸處含有1個(gè)C3HC4型RING鋅指結(jié)構(gòu)。

2.4 RING鋅指蛋白基因進(jìn)化樹(shù)分析

利用NCBI網(wǎng)站經(jīng)Blast找到11條同源性高的鋅指蛋白序列，這些序列來(lái)自擬南芥（Arabidopsis thaliana）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、蕪菁（Brassica rapa）、 葡萄（Vitis vinifera）、 大豆（Glycine max）、鷹嘴豆（Cicer arietinum）、西紅柿（Solanum lycopersicum）、 黃瓜（Cucumis sativus）， 一致性范圍為40%～100%。多序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)， RING鋅指蛋白在N-端跨膜區(qū)和C-端RING鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)較為保守（圖5）。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，小白菜同蕪菁（ABK56013.1）、 擬南芥（NP 173506.1、 XP 002890411.1）親緣關(guān)系最近， 說(shuō)明它們具有類似的結(jié)構(gòu)和功能， 但與西紅柿（XP 004238452.1）、黃瓜（XP004145558.1）的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖6）。

2.5 RING鋅指蛋白基因在銅脅迫下的特異性表達(dá)

為研究小白菜對(duì)銅脅迫的應(yīng)答，用Real-time PCR檢測(cè)銅脅迫0、5、10、15、20 d的葉片中RING鋅指蛋白的表達(dá)（圖7），結(jié)果顯示在銅脅迫下RING鋅指蛋白基因的表達(dá)量顯著降低，且在銅脅迫的早期其表達(dá)量就顯著降低，表明RING鋅指蛋白在感受到逆境脅迫后很早就參與到植物的逆境應(yīng)答反應(yīng)。

3 討論與結(jié)論

鋅指蛋白屬于轉(zhuǎn)錄因子家族，普遍存在于植物中，是真核生物中總數(shù)最大的DNA結(jié)合蛋白，在植物防衛(wèi)基因表達(dá)和抗逆反應(yīng)上起重要作用，目前已鑒定的鋅指蛋白大多屬于C2H2型。本研究首次從小白菜中克隆了855 bp的C3HC4型RING鋅指蛋白的cDNA全長(zhǎng)序列，結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，該蛋白N-端ɑ螺旋區(qū)具有較強(qiáng)的疏水性，C-端具有一個(gè)RING鋅指結(jié)構(gòu)。其中RING結(jié)構(gòu)域普遍具有泛素連接酶E3活性，能夠與UbcH5c結(jié)合催化自身標(biāo)簽上的賴氨酸殘基與泛素結(jié)合，發(fā)揮泛素連接酶E3活性，募集到特殊的泛素結(jié)合酶E2和底物[21-22]，植物細(xì)胞內(nèi)80%～90%的異常蛋白都是通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解[24]。小白菜RING鋅指蛋白在降解蛋白方面的功能有待進(jìn)一步的研究。

RING鋅指蛋白在調(diào)控植物防御生物和非生物脅迫反應(yīng)上具有重要作用。許多研究結(jié)果證明，干旱、低溫、高鹽等逆境脅迫可以明顯提高矮牽牛ZPT2-3[25]、水稻OsZFP1、OsRHC22[26-27]、降低了鋅指蛋白與DNA結(jié)合的特異性，使基因處于較低表達(dá)狀態(tài)，但其具體的響應(yīng)機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯：黃東杰