董麗輝等

摘要：為了從蛇足石杉[Huperzia serrata （Thunb.）Trev.]中分離出能產(chǎn)生清除DPPH·和抑制乙酰膽堿酯酶活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌，采用平板分離蛇足石杉內(nèi)生真菌，搖瓶發(fā)酵并測定其發(fā)酵液和菌絲體提取物清除DPPH自由基、抑制乙酰膽堿酯酶活性的能力，形態(tài)學(xué)和ITS-rDNA序列分析法鑒定獲得的部分內(nèi)生真菌。結(jié)果表明，共分離得到94株內(nèi)生真菌，有31株內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物顯示出乙酰膽堿酯酶抑制活性，其中18株具有顯著的抑制活性，

關(guān)鍵詞：蛇足石杉[Huperzia serrata （Thunb.）Trev.]；DPPH·；乙酰膽堿酯酶；內(nèi)生真菌

中圖分類號：S567 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）04-0888-06

Effects of Endophytic Fungi Isolated from Huperzia serrata on Scavening DPPH· and AchE Inhibitory

DONG Li-hui1，F(xiàn)AN San-wei1，LING Qing-zhi1，QIAN Hai-feng1，WEI Zhao-jun2

（1.Zhejiang Pharmaceutical College， Ningbo 315100，Zhejiang，China；

2.School of Biotechnology and Food Engineering， Hefei Universuity of Technology，Hefei 230009，China）

Abstract： The endophytic fungi isolated from Huperzia serrate by plate were fermented and identified by morphological characters and ITS-rDNA sequence. The effects of the extracts from fermented broth and mycelium on DPPH· scavenging ratio and inhibition ratio for AchE were investigated. The results showed that 94 endophytic fungis were isolated from Huperzia serrate 31 strains of them exhibited inhibition activity to AChE， while 18 strains isolated from stem（9）， leave（8） and root（1） had significan inhibition rate ranged from 50.3% to 82.78%. The fermentation of 5 strains such as S22， S29， L44， S79 and S94 had both activity of AchE-inhibitory and antioxidant. Through ITS-rDNA sequence analysis the five strains were identified as Arthrinium sp.， Podospora sp， Trichoderma sp.， Colletotrichum sp. and Colletotrichum sp.， respectively. It is indicated that there are endophytic fungi with antioxidant and AchE inhibitory activity in Huperzia serrate.

Key words： Huperzia serrate； DPPH·； AChE； endophytic fungi

蛇足石杉[Huperzia serrata（Thunb.）Trev.]屬于石杉科（Huperiaceae）石杉屬（Huperzia Bernh.）的蕨類植物，近年的研究[1-5]表明，蛇足石杉的主要藥效成分——石杉堿甲（Huperzine A）是一種強效的乙酰膽堿酯酶（Actylcholinesterase，AchE）抑制劑，用于治療重癥肌無力，能改善老年性記憶功能減退，與其他同類產(chǎn)品相比，副作用小[6]，是目前臨床上用于治療老年性癡呆癥（Alzheimers disease，AD）的最有效的藥物。研究表明，石杉堿甲能夠保護神經(jīng)元細胞對抗β-淀粉樣蛋白產(chǎn)生的毒性，并提高超氧化物歧化酶（SOD）的產(chǎn)生[7，8]。據(jù)研究報道，石杉堿甲能通過刺激超氧化物歧化酶（SOD）的產(chǎn)生而加快氧自由基的清除，減少自由基損傷，保護細胞免受損傷，從而起到治療老年性癡呆的作用[9]。因乙酰膽堿酯酶抑制劑和抗氧化劑均有治療老年性癡呆癥的作用，所以篩選過程中可以將具有抑制乙酰膽堿酯酶活性和抗氧化功能作為篩選的依據(jù)。

由于野生的蛇足石杉生長非常緩慢，其資源稀少，并且全草中的石杉堿甲含量僅在0.006%～0.012%，石杉堿甲的人工合成品尚無臨床活性，目前石杉堿甲的來源完全依賴野生資源，所以尋找新的石杉堿甲的來源尤為迫切。近年來，國內(nèi)的學(xué)者從石杉科植物中分離篩選出數(shù)株產(chǎn)石杉堿甲的內(nèi)生真菌[10-12]。從內(nèi)生真菌的分離研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛇足石杉的內(nèi)生真菌的種類繁多，內(nèi)生菌的數(shù)量也非常大，這使篩選目標菌株的工作量非常大，目標菌株的命中率低。

本試驗對蛇足石杉植株莖、葉、根內(nèi)生真菌進行了分離、純化與鑒定，在前期研究的基礎(chǔ)上，以具有抑制乙酰膽堿酯酶活性和清除DPPH自由基活性為雙重篩選目標，對分離得到的內(nèi)生真菌進行篩選，取得了可喜的結(jié)果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為采自浙江天目山脈的藥用植物蛇足石杉[Huperzia serrata （Thunb.） Trev.]。

1.2 儀器與試劑

Multiskan Spectrum型多功能酶標儀（美國Thermo Labsystems公司）；XSP-C型生物電子顯微鏡（上海上光新光學(xué)科技有限公司）；電泳儀及電泳槽（美國Bio-Rad公司）；PCR反應(yīng)擴增儀（加拿大BBI公司）；3730測序分析儀（美國ABI公司）。

碘化硫代乙酰膽堿（Acetylthiocholine iodide，ATCI）、5，5-二硫代-2-硝基苯甲酸（Dithiobis-nitrobenzoic acid，DTNB）、乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）均為Sigma公司產(chǎn)品；無水乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純；ITS-rDNA引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 方法

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌種類及其在蛇足石杉體內(nèi)的分布

從蛇足石杉中共分離到94株不同內(nèi)生真菌，這些內(nèi)生菌在植株中分布結(jié)果詳見表1。其中莖中所含內(nèi)生真菌最多，為49株，占總菌株數(shù)的52.13%；其次為葉片的38株，占40.43%；根內(nèi)最少，僅7株，占7.45%。

在對蛇足石杉植株進行內(nèi)生真菌分離過程中發(fā)現(xiàn)，莖和葉的內(nèi)生真菌要比根豐富，從根部分離到的內(nèi)生真菌數(shù)量較少，僅7株，占7.45%?？梢妰?nèi)生真菌在植物組織具有不同的生理分布，另一方面可能是根和葉片對消毒劑更加敏感，因此在消毒過程中，應(yīng)該根據(jù)不同的組織材料選擇最佳的消毒時間。

對分離獲得的94個內(nèi)生真菌，根據(jù)其菌落大小、形態(tài)、顏色以及菌絲和孢子的顯微特征，可將其歸屬為Penicillium sp.、Cladosporium sp.、Colletotrichum sp.、Acremonium sp.、 Mortierella sp.、 Paraconiothyrium sp.、 Leptosphaeria sp.、 Shiraia sp.、 Arthrinium sp.、Podospora sp.等12個屬，其中Penicillium sp.，Colletotrichum sp.、Podospora sp.為優(yōu)勢類群，占總菌數(shù)的22.34%、14.89%、14.89%。其中莖部分離到的49株菌分布在這12個屬中的10個屬，并且在Penicillium sp.中占有很大的比重，葉中分離到的38株菌也分布在10個屬中，并且在Podospora sp.中占有最大的數(shù)目，根分離到內(nèi)生真菌7株涉及5個屬（表1）。結(jié)果顯示蛇足石杉的內(nèi)生真菌有豐富的物種多樣性。

2.2 內(nèi)生真菌菌絲體提取物和發(fā)酵液提取物的乙酰膽堿酯酶抑制活性

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