劉長(zhǎng)根，徐 飛，賈紅華，周 華，韋 萍

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，南京 211800)

苯甲醛是一種重要的化工原料，廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、香料及染料等行業(yè)。生產(chǎn)苯甲醛的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法是采用芐叉二氯水解法［1］和甲苯氧化法［2］。其中，芐叉二氯水解法存在工藝流程長(zhǎng)、產(chǎn)物分離困難、產(chǎn)品中含氯元素且排放出腐蝕性氣體等不足，污染環(huán)境嚴(yán)重;甲苯氧化法是利用金屬催化劑直接選擇性氧化制備苯甲醛，雖然工藝過(guò)程簡(jiǎn)單，但產(chǎn)物產(chǎn)率較低。

漆酶在氧化反應(yīng)中的應(yīng)用研究較多，但主要偏重研究酚類、胺類和木質(zhì)素類等［3-6］化合物的氧化，目前對(duì)醇類化合物的氧化研究較少，而且主要側(cè)重于對(duì)氧化反應(yīng)機(jī)制的研究［7-11］，專門(mén)針對(duì)苯甲醇的氧化研究偏少，尤其是對(duì)反應(yīng)底物濃度(一般底物反應(yīng)濃度為20 mmol/L，偏低)、氫受體種類及反應(yīng)溶劑等反應(yīng)工藝參數(shù)優(yōu)化的研究更未見(jiàn)報(bào)道。

為此，筆者以自制的高活性漆酶為催化劑，研究苯甲醇催化氧化制備苯甲醛，通過(guò)氧化反應(yīng)條件的優(yōu)化研究，為苯甲醛的高效綠色合成奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

苯甲醇(分析純)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;2，2-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)(98%)，東京化成工業(yè)株式會(huì)社;2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO)(98%)，阿拉丁公司;無(wú)水1-羥基-苯并-三氮唑(HBT)(98%)，上海晶純?cè)噭┯邢薰?紫脲酸(VLA)(97%)，F(xiàn)luka公司;其他試劑均為市售分析純。

1.1.2 主要儀器

SP-6890型氣相色譜儀(山東魯南瑞虹化工儀器有限公司)，HTZ-C-1臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器(太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)，PHS-3C型pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 漆酶的發(fā)酵及提取方法

以筆者所在實(shí)驗(yàn)室篩選的白腐菌Coriolus versicolor ZHH為菌種，經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后得到含酶發(fā)酵液，離心去除菌體等固形物，加入(NH4)2SO4、離心獲得沉淀，經(jīng)冷凍干燥獲得漆酶干粉，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 苯甲醇氧化反應(yīng)方法

初始氧化反應(yīng)條件:在25 mL的反應(yīng)瓶中加入20 mmol/L苯甲醇溶液和40 U/mL漆酶，總反應(yīng)體積為10 mL，30℃、通O20.5 h后密閉振蕩反應(yīng)24 h;反應(yīng)結(jié)束后取樣測(cè)定底物和產(chǎn)物濃度，計(jì)算反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。

1.2.3 漆酶酶活的測(cè)定方法

以ABTS為底物，在420 nm條件下測(cè)定漆酶酶活，具體方法參照文獻(xiàn)［12-13］。

1.2.4 底物與產(chǎn)物的檢測(cè)方法

反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液用二氯甲烷萃取3次，去除水相，含底物和產(chǎn)物的有機(jī)相直接利用氣相色譜測(cè)定濃度。色譜柱為安捷倫DB-225毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm ×0.25 um)，具體分析方法參照文獻(xiàn)［14］。

2 結(jié)果與討論

2.1 介質(zhì)體系對(duì)苯甲醇氧化反應(yīng)的影響

2.1.1 介質(zhì)體系的選擇

漆酶的氧化還原電勢(shì)較低，苯甲醇結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，必須借助電子傳遞介質(zhì)能夠完成反應(yīng)。故在初始反應(yīng)條件下，考察不同電子傳遞介質(zhì)ABTS、HBT、VLA和TEMPO(10 mmol/L)對(duì)苯甲醇氧化反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 介質(zhì)體系對(duì)苯甲醛產(chǎn)率的影響ig.1 Effects of medium system of on yield of benzaldehyde

從圖1可看出，介質(zhì)TEMPO的加入對(duì)漆酶催化苯甲醇制備苯甲醛氧化反應(yīng)的效率最高(58%)，故以下實(shí)驗(yàn)均加入TEMPO作為氧化反應(yīng)介質(zhì)體系。

2.1.2 TEMPO的用量對(duì)苯甲醛產(chǎn)率的影響

考察TEMPO的用量對(duì)苯甲醛產(chǎn)率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知:當(dāng)TEMPO與苯甲醇的質(zhì)量摩爾比為1∶4時(shí)，苯甲醛的產(chǎn)率最高，達(dá)到71%。

圖2 TEMPO與苯甲醇的摩爾濃度比對(duì)苯甲醛產(chǎn)率的影響Fig.2 Effects of TEMPO and benzene methanol molar concentration ratio on yield of benzaldehyde

2.2 底物濃度對(duì)氧化反應(yīng)的影響

目前，漆酶氧化醇類化合物的研究中底物濃度一般選擇為20 mmol/L，較低的底物及產(chǎn)物濃度必將給工藝放大與應(yīng)用帶來(lái)諸多麻煩，因此提高底物的反應(yīng)濃度對(duì)于苯甲醛的酶法制備具有積極意義。在反應(yīng)體系中考察不同底物濃度(20、40、60、80和100 mmol/L)，加入40 U/mL漆酶和上述濃度的TEMPO，30 ℃、通O20.5 h密閉振蕩反應(yīng)24 h，測(cè)定反應(yīng)體系中苯甲醛的產(chǎn)率，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 苯甲醇濃度對(duì)苯甲醛產(chǎn)率的影響Fig.3 Effects of concentration of benzyl alcohol on yield of benzaldehyde

由圖3可知:隨著底物濃度的提高，氧化反應(yīng)收率仍保持較高的水平，表明漆酶對(duì)高濃度底物有較好的耐受性，當(dāng)?shù)孜锉郊状嫉臐舛葹?0 mmol/L，反應(yīng)體系的苯甲醛產(chǎn)率最高，可達(dá)到76%。

2.3 漆酶用量對(duì)氧化反應(yīng)的影響

為進(jìn)一步提高氧化反應(yīng)得率、降低漆酶用量，在上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，在反應(yīng)體系中采用不同漆酶用量(10、40、60、80、100 和 150 U/mL)進(jìn)行氧化反應(yīng)，測(cè)定苯甲醛的產(chǎn)率，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 漆酶用量對(duì)苯甲醛產(chǎn)率的影響Fig.4 Effects of concentration of laccase on yield of benzaldehyde

由圖4可知:苯甲醛的產(chǎn)率并未隨著漆酶用量的增加而增加，當(dāng)反應(yīng)體系中加入80 U/mL的漆酶時(shí)，苯甲醛的產(chǎn)率達(dá)到80%。

2.4 氫受體對(duì)氧化反應(yīng)的影響

氫受體能夠接受電子被還原，從而促進(jìn)苯甲醇的氧化反應(yīng)。在前面優(yōu)化條件基礎(chǔ)上，考察不同氫受體(丙酮、甲醛、戊二醛和乙醛)對(duì)苯甲醛產(chǎn)率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知:丙酮作為氫受體效果最好。同時(shí)，考察不同丙酮濃度對(duì)苯甲醛產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，當(dāng)丙酮的加入量為60 mmol/L時(shí)，苯甲醛產(chǎn)率最高，達(dá)到89%。

圖5 氫受體對(duì)苯甲醛產(chǎn)率的影響Fig.5 Effects of hydrogen acceptor on yield of benzaldehyde

圖6 丙酮濃度對(duì)苯甲醛產(chǎn)率的影響Fig.6 Effects of acetone concentration on yield of benzaldehyde

2.5 助溶劑對(duì)氧化反應(yīng)的影響

由于產(chǎn)物苯甲醛不溶于水，反應(yīng)體系中加入少量有機(jī)溶劑可以促進(jìn)苯甲醛向有機(jī)相的轉(zhuǎn)移，推動(dòng)反應(yīng)向產(chǎn)物方向進(jìn)行，提高產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化得率。在上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件基礎(chǔ)上，考察不同有機(jī)溶劑(丁二酸二甲酯、環(huán)氧己烷、四氫呋喃、乙腈、乙酸乙酯和正丁酸，0.5 mol/L)對(duì)氧化反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知:助溶劑的加入對(duì)苯甲醛的收率提高沒(méi)有促進(jìn)作用，結(jié)合下游產(chǎn)物分離成本，故反應(yīng)中不考慮添加助溶劑。

2.6 通氧方式對(duì)反應(yīng)的影響

O2是氧化反應(yīng)的必要因素，由于O2在反應(yīng)溶液中溶解度較低，故不同的供氧方式影響氧化反應(yīng)的得率。在上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通O20.5 h后，再考察不同通氧方式(密封、敞開(kāi)和連續(xù)通氧等)對(duì)氧化反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8。

由圖8知:通O20.5 h后密閉反應(yīng)時(shí)，苯甲醛的產(chǎn)率最高，達(dá)94%。敞開(kāi)反應(yīng)時(shí)，苯甲醛的產(chǎn)率最低。這可能是氧化反應(yīng)需要一定量O2的參與，但過(guò)高的O2濃度對(duì)酶會(huì)產(chǎn)生中毒作用、導(dǎo)致反應(yīng)率下降。

圖7 助溶劑對(duì)苯甲醛產(chǎn)率的影響Fig.7 Effects of different solvent system on yield of benzaldehyde

圖8 供氧方式對(duì)苯甲醛產(chǎn)率的影響Fig.8 Effect of oxygen supply mode on yield of benzaldehyde

同時(shí)考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)苯甲醛產(chǎn)率的影響，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)36 h苯甲醛的最高產(chǎn)率為98%(圖9)。

圖9 反應(yīng)時(shí)間對(duì)苯甲醛產(chǎn)率的影響ig.9 Effects of reaction time of on yield of benzaldehyde

3 結(jié)論

以自制的高活性漆酶為催化劑，開(kāi)展了漆酶催化苯甲醇制備苯甲醛的合成工藝優(yōu)化研究。經(jīng)過(guò)優(yōu)化得到的最佳工藝條件為以80 U/mL的漆酶為催化劑，在檸檬酸/檸檬酸鈉反應(yīng)體系中，以 TEPMO為介質(zhì)體系(TEMPO與底物苯甲醇的最佳摩爾濃度比為1∶4)、60 mmol/L的丙酮為氫受體，60 mmol/L的苯甲醇在通O20.5 h后密閉反應(yīng)36 h，最終苯甲醛的產(chǎn)率達(dá)98%，為酶法制備苯甲醛的工藝放大與應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。

［1］ 柳艷修，宋華，王寶輝.甲苯直接氧化制苯甲醛研究進(jìn)展［J］.工業(yè)催化，2005，13(2):24-28.

［2］ 葛欣，張惠良，范軍.鈰鉬氧化物對(duì)甲苯氣相選擇氧化制苯甲醛的催化性能［J］.催化學(xué)報(bào)，1998，19(1):42-46.

［3］ Bettin F，Montanari Q，Calloni R，et al.Production of laccases in submerged process by Pleurotus sajor-caju PS-2001 in relation to carbon and organic nitrogen sources，antifoams and Tween 80［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2009，36(1):1-9.

［4］ Kim S，Kim D，Park J.Synthesis of 2，5-diaminoquinones by onepot copper-catalyzed aerobic oxidation of hydroquinones and addition reaction of amines［J］.Adv Synth Catal，2009，351(16):2573-2578.

［5］ Rodriguez E，Nuero O，Guillén F，et al.Degradation of phenolic and non-phenolic aromatic pollutants by four Pleurotus species:the role of laccase and versatile peroxidase［J］.Soil Biol Biochem，2004，36(6):909-916.

［6］ Kluczek-Turpeinen B，Tuomela M，Hatakka A，et al.Lignin degradation in a compost environment by the deuteromycete Paecilomyces inflatus［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2003，61(4):374-379.

［7］ Barreca A M，F(xiàn)abbrini M，Gali C，et al.Laccase/mediated oxidation of a lignin model for improved delignification procedures［J］.J Mol Catal B:Enzymatic，2003，26(1/2):105-110.

［8］ Arzola K G，Arevalo M C，F(xiàn)alcon M A.Catalytic efficiency of natural and synthetic compounds used as laccase-mediators in oxidising veratryl alcohol and akraftlignin，estimated by electrochemical analysis［J］.Electrochim Acta，2009，54(9):2621-2629.

［9］ Hong F，J?nsson L J，Lundquist K，et al.Oxidation capacity of laccases and peroxidasesasreflected in experimentswith methoxy-substituted benzyl alcohols［J］. Appl Biochem Biotechnol，2006，129(1/2/3):303-319.

［10］ Liebminger S，Siebenhofer M，Guebitz G.Oxidation of glycerol by 2，2，6，6-tetramethylpiperidine-N-oxyl(TEMPO)in the presence of laccase［J］.Bioresour Technol，2009，100(20):4541-4545.

［11］ d'Acunzo F，Baiocco P，F(xiàn)abbrini M，et al.A mechanistic survey of the oxidation of alcohols and ethers with the enzyme laccase and its mediation by TEMPO［J］.Eur J Org Chem，2002，2002:4195-4201.

［12］ 何為，詹懷宇，王習(xí)文，等.一種改進(jìn)的漆酶酶活檢測(cè)方法［J］.華南理工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2003，31(12):46-57.

［13］ 張鵬.以ABTS為底物測(cè)定漆酶活力的方法［J］.印染助劑，2007，24(1):43-45.

［14］ 譚平華，唐盛偉，劉長(zhǎng)軍，等，氣相色譜法同時(shí)測(cè)定苯甲醛、苯甲醇和苯甲酸［J］.天然氣化工，2007，32(2):64-66.