新疆地區(qū)冠心病穢濁痰阻證動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究*

王昕宇 楊 劍 安冬青△

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011）

新疆地區(qū)冠心病穢濁痰阻證動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究*

王昕宇1楊 劍2安冬青1△

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011）

目的通過(guò)人工氣候箱結(jié)合喂養(yǎng)高脂飼料并腹腔注射維生素D3，建立新疆地區(qū)冠心病穢濁痰阻證大鼠模型。通過(guò)組織切片、血清指標(biāo)，摸索模型建立條件。方法按RCT原則，將20只SD大鼠分為空白對(duì)照組、穢濁痰阻證模型組，每組10只?？瞻讓?duì)照組正常飲水喂基礎(chǔ)飼料；穢濁痰阻證模型組正常飲水喂高脂飼料并腹腔注射維生素D3，同時(shí)每日固定11 h在人工氣候箱寒燥條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)第13周，行大鼠主動(dòng)脈瓣至髂腎動(dòng)脈分支處動(dòng)脈及肝臟組織切片檢查；測(cè)體質(zhì)量、血清總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇、血清白細(xì)胞介素6、腫瘤壞死因子-α。結(jié)果兩組大鼠體質(zhì)量、血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇、IL-6、TNF-α差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；動(dòng)脈血管壁內(nèi)膜下見(jiàn)無(wú)定形物質(zhì)沉積，有泡沫樣細(xì)胞；肝組織外周出現(xiàn)中度肝脂肪變性。結(jié)論冠心病穢濁痰阻證大鼠模型，基本表現(xiàn)出新疆地區(qū)冠心病穢濁痰阻證辨證要點(diǎn)，初步推測(cè)造模方法具有一定可行性。

冠心病穢濁痰阻證大鼠模型 血脂 組織切片 白細(xì)胞介素6 腫瘤壞死因子α

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦莿?dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致器官病變的最常見(jiàn)類型。胸痹心痛根據(jù)其臨床證狀特點(diǎn)，類似于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)之冠心?。?］。本課題組對(duì)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院心血管?？凭驮\的2215例確診為冠心病的患者的辨證分型及常見(jiàn)癥狀的發(fā)生頻度分析，發(fā)現(xiàn)新疆地區(qū)胸痹以五臟虛損、穢濁痰濕阻于脈絡(luò)形成血瘀，氣虛、穢濁痰濕、瘀血交織最為多見(jiàn)，即穢濁痰阻氣虛血瘀證是新疆地區(qū)胸痹的主要證型［2］；誘發(fā)因素包括年齡、脂質(zhì)代謝異常、高血壓、肥胖、飲食、寒冷、干旱少雨、沙塵風(fēng)暴、沙塵花粉等［3-4］。本課題組將誘發(fā)冠心病的危險(xiǎn)因素與新疆地區(qū)冠心病穢濁痰阻證的證候結(jié)合，嘗試建立“病證結(jié)合”的動(dòng)物模型，以探討冠心病的病理、生理變化與中醫(yī)證候特征之間的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠20只，雄性，體質(zhì)量（160± 20）g，新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（通過(guò)北京動(dòng)物管理委員會(huì)評(píng)估認(rèn)證）。飼養(yǎng)條件：標(biāo)準(zhǔn)飼料，溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度40％～70％，通風(fēng)光照良好。

1.2 藥物與試劑 藥物：膽固醇（北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)010927）、去氧膽酸鈉 （廣東環(huán)凱微生物科技公司，批號(hào)200701023）、丙基硫氧嘧啶（深圳市中聯(lián)制藥有限公司，批號(hào)0610312）、維生素D3（上海第九制藥廠，批號(hào)980802）。試劑：血清總膽固醇（T-CHO）試劑盒（貨號(hào)A030，批號(hào)200804011）、三酰甘油（TG）試劑盒（貨號(hào)A035，批號(hào)200704032）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒（貨號(hào)A027，批號(hào)200706120）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒（貨號(hào)A028，批號(hào)200804091）、極低密度脂蛋白膽固醇（VLDL-C）試劑盒（貨號(hào)A029，批號(hào)200803225）、大鼠血清白細(xì)胞介素6（IL-6）試劑盒（批號(hào)201011215）、大鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（批號(hào)201007421），均購(gòu)自長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司；10％甲醛固定液，10％烏拉坦溶液等。

1.3 儀器 MIC400人工氣候箱 （上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、臺(tái)式天平、C390高速低溫離心機(jī)（Sigma公司）、分離膠采血管、OLYMPUS-AU5421型全自動(dòng)生化分析儀 （日本O-LYMPUS公司）、OLYMPUS BH-2熒光顯微鏡 （日本OLYM-PUS公司）、LEICA RM2135型切片機(jī)（德國(guó)LEICA公司）、酶標(biāo)儀。

1.4 分組及給藥 分組：按RCT原則，將20只SD雄性大鼠分為空白對(duì)照組、穢濁痰阻證模型組，每組10只。高脂飼料制備：71.3％的標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)飼料中，加入3％膽固醇、0.5％去氧膽酸鈉、0.2％丙基硫氧嘧啶、5％白糖、20％豬油（將各物人工充分混勻，再經(jīng)加熱溶化的豬油攪拌，壓成圓條狀飼料備用）［5-8］。模型制備：造模共12周。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。在喂食高脂飼料第1周第1日，第1次腹腔注射維生素D360萬(wàn)IU/kg；第5周第1日，第2次腹腔注射維生素D360萬(wàn)IU/kg；第9周第1日，第3次腹腔注射維生素D360萬(wàn)IU/kg；空白對(duì)照組相同時(shí)間，3次腹腔注射同等單位0.9％氯化鈉注射液［5-8］。同時(shí)，穢濁痰阻證模型組大鼠，每日9∶00～20∶00，放入人工氣候箱。人工氣候箱系統(tǒng)設(shè)定為（6±2）℃，相對(duì)濕度25％～32.8％［9-10］。以模擬新疆地區(qū)環(huán)境。

1.5 動(dòng)物處理及指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)第13周第1日，處死19只大鼠（模型組1只大鼠實(shí)驗(yàn)中途死亡），行大鼠主動(dòng)脈瓣至髂腎動(dòng)脈分支處動(dòng)脈及肝臟組織病理切片檢查；檢測(cè)體質(zhì)量、血清 TC、TG、HDL-C、LDL-C、VLDL-C、IL-6、TNF-α。

1.6 主動(dòng)脈瓣至髂腎動(dòng)脈分支處動(dòng)脈、肝臟組織切片檢查 實(shí)驗(yàn)第13周，兩組大鼠禁食不禁水12 h，用10％烏拉坦溶液（0.01 mL/kg）麻醉，沿主動(dòng)脈瓣至髂腎動(dòng)脈分支處剝離動(dòng)脈，縱向剪開(kāi)，在10％甲醛溶液中固定3 d；將新鮮采集的肝臟組織置10％甲醛溶液固定3 d。兩部分標(biāo)本行脫水、二甲苯透明、三步石蠟法制病理切片，光鏡觀察截取圖片。

1.7 血脂、IL-6、TNF-α檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)第13周，將兩組大鼠禁食不禁水12 h，用10％烏拉坦溶液 （0.01 mL/kg）麻醉，用分離膠心臟采血管采血5 mL，高速低溫離心機(jī)3500 r/min離心10 min，2～8℃靜置。行TC、TG、HDL-C、LDL-C、VLDL-C檢測(cè)；IL-6、TNF-α（ELISA）檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，正態(tài)性、方差齊用單因素方差分析LSD檢驗(yàn)，方差不齊用單因素方差分析的Dunnett’s T3檢驗(yàn)。非正態(tài)性資料用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)指征評(píng)價(jià)及死亡情況 空白對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，毛色較白有光澤，目睛光亮有神，反應(yīng)靈敏，飼喂時(shí)有較大反應(yīng)，不斷抓撓食盒，舌質(zhì)暗紅，舌無(wú)苔，大便干結(jié)成顆粒狀。穢濁痰阻證模型組大鼠從3周左右開(kāi)始發(fā)現(xiàn)精神欠佳，目光呆滯，活動(dòng)少，飲食減少；7周左右飼喂時(shí)較少有反應(yīng)，喜臥少動(dòng)，飲食有所減少，毛色變暗；10周左右發(fā)現(xiàn)目睛混濁，飲食略有增加。舌質(zhì)暗紫有瘀斑，舌苔薄膩、大便黏滯不成形。穢濁痰阻證模型組4號(hào)大鼠，因厭食、逐漸消瘦致體質(zhì)較差，于實(shí)驗(yàn)第5周死亡，未行尸檢。造模成功率95％。

2.2 兩組大鼠體質(zhì)量比較 造模后空白組大鼠平均體質(zhì)量為（336.0800±31.5062）g，穢濁痰阻證模型組大鼠平均體質(zhì)量為（225.1111±34.6751）g，穢濁痰阻證模型組大鼠體質(zhì)量較造模前明顯增高，但較之空白對(duì)照組，體質(zhì)量偏低（P＜0.05）。

2.3 兩組大鼠血脂指標(biāo)及IL-6、TNF-α比較 見(jiàn)表1，表2。結(jié)果示T-CHO、LDL-C、VLDL-L、IL-6、TNF-α差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而TG、HDL-C差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 兩組大鼠造模后血脂指標(biāo)比較（mmol/L，±s）

表1 兩組大鼠造模后血脂指標(biāo)比較（mmol/L，±s）

與穢濁痰阻證模型組比較，*P＜0.05。下同。

組 別 TG HDL-C空白對(duì)照組 1.2800±0.33807 1.3160±0.19283穢濁痰阻證模型組 2.4433±1.18128 1.4600±0.63370 n TC 10 2.0620±0.24912*9 16.1422±9.10956

表2 兩組大鼠造模后血脂、血清指標(biāo)比較（mmol/L，±s）

表2 兩組大鼠造模后血脂、血清指標(biāo)比較（mmol/L，±s）

組 別n IL-6（pg/mL）TNF-α（ng/mL）空白對(duì)照組 127.94±32.80* 182.42±17.45*穢濁痰阻證模型組 484.31±171.26 407.71±99.73 10 9 LDL-C（mmol/L）VLDL-C（mmol/L）0.2030±0.03335* 0.5430±0.08433*6.6867±4.19984 7.9956±4.50373

2.4 主動(dòng)脈瓣至髂腎動(dòng)脈分支處動(dòng)脈、肝臟組織切片檢查 主動(dòng)脈具有早期動(dòng)脈粥樣硬化（AS）斑塊病理傾向，以動(dòng)脈分叉開(kāi)口處較多，說(shuō)明血流動(dòng)力學(xué)在AS的進(jìn)程中起一定作用，在動(dòng)脈分叉開(kāi)口處血流方向改變，渦流增加，對(duì)動(dòng)脈內(nèi)膜沖擊損傷作用增強(qiáng)，促進(jìn)AS病變形成。

2.5 組織切片比較 組織切片顯示穢濁痰阻證模型組大鼠動(dòng)脈及肝臟組織均不同程度地出現(xiàn)AS早期病理表現(xiàn)，即動(dòng)脈以內(nèi)膜下層泡沫細(xì)胞出現(xiàn)、無(wú)定形物質(zhì)沉積為主要表現(xiàn)。

圖1 主動(dòng)脈瓣至髂腎動(dòng)脈分支處選取的動(dòng)脈組織切片比較（×400）

圖2 肝臟組織切片比較（×200）

2.6 主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度、泡沫細(xì)胞比較 見(jiàn)表3。結(jié)果示兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 兩組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度、泡沫細(xì)胞比較（±s）

表3 兩組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度、泡沫細(xì)胞比較（±s）

組 別 泡沫細(xì)胞（％）空白對(duì)照組 3.64±0.54*穢濁痰阻證模型組 35.87±5.71 n 內(nèi)膜厚度（μm）10 11.84±3.68*9 48.41±14.61

3 討論

穢濁痰阻證模型組大鼠TC、LDL-C、VLDL-C均顯著增高，均是誘發(fā)AS病變的危險(xiǎn)因素。體質(zhì)量方面，穢濁痰阻證模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，一方面與高脂飼料誘發(fā)脂質(zhì)代謝失常密切相關(guān)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物食欲下降；另一方有文獻(xiàn)顯示，高脂飼料結(jié)合維生素D3的造模方法在實(shí)驗(yàn)第10周時(shí)，體質(zhì)量會(huì)逐漸恢復(fù)增長(zhǎng)趨勢(shì)［11］。人工氣候箱的寒燥環(huán)境易傷脾胃，使水谷運(yùn)化失常、久化痰濁、濁氣不降、清氣不升，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)嗜睡懶動(dòng)、反應(yīng)遲緩、活動(dòng)能力差、大便黏滯不成形等一系列表現(xiàn)。燥邪侵?jǐn)_，痰濕凝結(jié)于血脈，導(dǎo)致大鼠舌質(zhì)暗紅或暗紫、苔膩。穢濁痰阻證大鼠模型基本表現(xiàn)出新疆冠心病穢濁痰阻證辨證要點(diǎn)。組織切片方面，穢濁痰阻證模型組大鼠動(dòng)脈及肝臟組織均不同程度出現(xiàn)AS早期病理表現(xiàn)，即動(dòng)脈以內(nèi)膜下層泡沫細(xì)胞出現(xiàn)、無(wú)定形物質(zhì)沉積為主要表現(xiàn)。大鼠TG、HDL-C均無(wú)明顯改變，可能與造模時(shí)間不足及鼠齡有關(guān)。

由于大鼠無(wú)膽囊，對(duì)膽固醇等脂質(zhì)吸收少，單純喂食高脂飼料很難誘導(dǎo)大鼠AS的形成，為保證穢濁痰阻證動(dòng)物模型的成功建立，在人工氣候箱寒燥環(huán)境下，飼料中添加了去氧膽酸鈉，以顯著增加大鼠小腸對(duì)膽固醇的吸收量。同時(shí)添加丙基硫氧嘧啶，抑制甲狀腺功能、減少大鼠對(duì)膽固醇的代謝，以確保血清總膽固醇含量的升高。高糖是另一個(gè)誘導(dǎo)AS的因素，在飼料中添加糖粉，不僅能促進(jìn)血糖升高，且糖分的粘合作用，使高脂飼料易于壓制成顆粒，便于大鼠的食用。維生素D能顯著促進(jìn)AS的發(fā)生，經(jīng)腹腔注射維生素D3后，血鈣濃度出現(xiàn)顯著升高，破壞動(dòng)脈管壁內(nèi)皮的完整性［12］。

本實(shí)驗(yàn)利用人工氣候箱，模擬新疆地區(qū)特殊的寒燥氣候，結(jié)合高脂飼料維生素D3混合喂養(yǎng)大鼠，以多樣化致病因素的重疊干預(yù)，反映了穢濁痰阻證的證候臨床特點(diǎn)，初步探索地新疆冠心病穢濁痰阻證“病證結(jié)合”動(dòng)物模型的建立條件，為課題組系列研究奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

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Study on Animal Model of Xinjiang Coronary Heart Disease with Phlegm-turbidity Syndrome

WANG Xin-yu，YANG Jian，AN Dong-qing. TCM College of Xinjiang Medical University，Xinjiang，Wulumuqi 830011，China

Objective：To establish animal model of Xinjiang coronary heart disease with phlegm-turbidity syndrome by combined treatment of artificial climate chamber，high-fat diet，abdominal injection of vitamin D3，and to explore animal model conditions by biopsy and serum index.M ethods：By RCT principle，20 SD rats were divided into normal control group and phlegm-turbidity syndrome group，10 rats in each group.Normal control group was fed the basis diet；phlegm-turbidity syndrome group was fed the high-fat diet，injected with vitamin D3，and fixed 11 hours a day in the artificial climate chamber of cold dry conditions.13 weeks later，tissue sections of aortic renal artery branch to iliac artery and liver were checked.Then weight，total cholesterol in serum，triglycerides，high-density lipoprotein cholesterol，low-density lipoprotein cholesterol，extremely low density lipoprotein cholesterol，interleukin-6in serum，and tumor necrosis factor-α were measured.Result：Compared with normal control group，body weight，total cholesterol in serum，low-density lipoprotein cholesterol，extremely low density lipoprotein cholesterol，serum interleukin-6，and tumor necrosis factor-α in model group had statistical differences （P＜0.05）.In aspects of triglycerides and high-density lipoprotein cholesterol，there were no significant differences（P＞0.05）.There were amorphous materials deposited under artery wall intima.Foam-like cells and moderate hepatic steatosis in liver tissue periphery were observed.Conclusions：Animal model demonstrates the basic clinical characters of Xinjiang coronary heart disease with phlegm-turbidity syndrome so modeling method is initially speculated of certain feasibility.

Animal model of coronary heart disease with phlegm-turbidity syndrome；Lipids；Tissue sections；IL-6；TNF-α

△通信作者

R285.5

A

1004-745X（2014）04-0585-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.04.009

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（2010211A24）；新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（XJDX0910-2009-04）

2013-12-25）