徐 露 黃 彥

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)生化與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；2.重慶市中醫(yī)院，重慶400021）

百裕銀杏內(nèi)酯注射液抑制家兔血小板聚集作用的實(shí)驗(yàn)研究*

徐 露1黃 彥2△

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)生化與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；2.重慶市中醫(yī)院，重慶400021）

目的觀察不同低劑量的百裕銀杏內(nèi)酯注射液對(duì)家兔血小板聚集功能、超微結(jié)構(gòu)及PF-4和β-TG的影響。方法將日本大耳兔分為百裕銀杏內(nèi)酯高、中、低劑量組及生理鹽水組，分別予相應(yīng)藥物靜注1周，采用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)法，觀察各組對(duì)血小板活化因子（PAF）誘導(dǎo)的家兔血小板聚集作用的影響，以及血小板超微結(jié)構(gòu)和PF-4和β-TG水平的變化。結(jié)果百裕銀杏內(nèi)酯各劑量組較生理鹽水組均能抑制PAF誘導(dǎo)的家兔血小板聚集，減少聚集型血小板數(shù)量并使樹突型血小板突起變少變短，降低 PF-4和β-TG的表達(dá)（P＜0.01）。結(jié)論百裕銀杏內(nèi)酯注射液能夠抑制PAF誘導(dǎo)的血小板聚集，抑制血小板的活化。

百裕銀杏內(nèi)酯注射液 血小板 血小板活化因子 電鏡

銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯是銀杏活血化瘀的有效成分［1］。百裕銀杏內(nèi)酯注射劑的主要成分為銀杏總內(nèi)酯（白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯ABC），其活血化瘀作用較強(qiáng)，對(duì)心腦血管疾病有顯著療效。為了證實(shí)百裕銀杏內(nèi)酯注射劑對(duì)血小板細(xì)胞膜上的血小板活化因子（PAF）受體的抑制作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證分析?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。健康日本大耳白兔40只，體質(zhì)量（2.0±0.2）kg，雌雄各半，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物合格證號(hào)XCXK（渝）20020001］。（2）實(shí)驗(yàn)藥物百裕銀杏內(nèi)酯（成都百裕制藥，批號(hào)20120303）。（3）試劑和儀器。血小板活化因子（PAF）（購(gòu)自cayman，批號(hào)012328）溶解于含0.25％小牛血清蛋白且pH為7.6的Tris-NaCl溶液中，其終濃度為3.6 nmol/L；枸櫞酸鈉（購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，批號(hào)20130117）溶于蒸餾水中，濃度為3.8％；兔β-血小板球蛋白 （β-TG）ELISA試劑盒 （FOCUS，批號(hào)20130224）；兔血小板因子-4（PF-4）ELISA試劑盒（FOCUS，批號(hào)20130301）；TYXN-96多功能智能血液凝聚儀（購(gòu)自上海通用技術(shù)研究所）；掃描電子顯微鏡S-3000N（日本日立公司）；ELX-800酶標(biāo)儀（美國(guó)寶特公司）。

1.2 分組及給藥 隨機(jī)將40只健康日本大耳兔隨機(jī)分為4組，每組10只。百裕銀杏內(nèi)酯高劑量組、百裕銀杏內(nèi)酯中劑量組、百裕銀杏內(nèi)酯低劑量組（以下分別簡(jiǎn)稱百裕高、百裕中和百裕低）分別以高（1.02 mL/kg）、中（0.51 mL/kg）、低（0.255 mL/kg）劑量靜脈注射給藥；生理鹽水組以0.9％氯化鈉注射液2 mL；各組給藥均每日1次，連續(xù)1周。

1.3 檢測(cè)血小板聚集率 每只家兔心臟取血10.5 mL，分出1.5 mL血漿取血清，其余9 mL血漿用3.8％枸櫞酸鈉以1∶9比例抗凝，轉(zhuǎn)速800 r/min離心10 min，取上清液，該上清液為富血小板血漿（PRP），將其分出100 μL PRP用于電鏡檢查，剩余PRP用于血小板聚集率的檢測(cè)；剩余液體以轉(zhuǎn)速3000 r/min離心15 min，去上清液為貧血小板血漿（PPP）。將PPP加入到PRP中，使PRP含有的血小板數(shù)目在360×109/L。檢測(cè)在10 μL PAF誘導(dǎo)下PRP中的1 min、5 min及最大血小板聚集率。

1.4 血小板電鏡觀察 將預(yù)先得到的100 μL PRP放入硅化EP管里，再加入1 μL的PAF，作用15 min后，將PRP吸出滴在鋪有方華膜的銅網(wǎng)上，在37℃下孵育10 min，超純水沖洗后以3％戊二醛固定5 min，再用超純水沖洗，銅網(wǎng)上的標(biāo)本干燥后，在樣本表面鍍20 nm的金膜，用S-3000N掃描電鏡觀察100個(gè)血小板形態(tài)，計(jì)算出各型血小板比例。電鏡下的血小板形態(tài)如下。（1）圓形：血小板呈圓形。體積小且一致，核心大，周邊透明帶低窄，中央致密。（2）樹形：由中央致密區(qū)生成單個(gè)或多個(gè)足突，有時(shí)有分枝，呈細(xì)長(zhǎng)或片狀。（3）展平形：中央有致密的核心，外圍有較寬透明帶，周邊較光滑或有小突起。（4）聚集形：由幾個(gè)到幾十個(gè)血小板組成的聚集體，其大小不等，可見血小板相互連接或完整融為一體，血小板在外周部的足突明顯。

1.5 血清中PF-4和β-TG含量水平的測(cè)定 向1.5 mL血漿中加入1 μL的PAF，誘導(dǎo)PF-4和β-TG的釋放，血漿于4℃靜置4 h，取200 μL血清，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)結(jié)果由酶標(biāo)儀進(jìn)行讀取。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示；采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)對(duì)各組血小板聚集率、血小板各型百分?jǐn)?shù)、PF-4和β-TG含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血小板聚集實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見表1?？梢娫赑AF誘導(dǎo)下，將百裕高、百裕中、百裕低的最大血小板聚集率分別與生理鹽水組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），以上各組血小板聚集抑制率均有提高，說(shuō)明高、中、低劑量的百裕銀杏內(nèi)酯注射液能對(duì)PAF誘導(dǎo)的血小板聚集產(chǎn)生抑制作用。

2.2 各組血小板電鏡檢測(cè)結(jié)果比較 見表2。在PAF誘導(dǎo)下，百裕高、百裕中、百裕低組聚集型血小板少見，血小板大小一致，細(xì)胞表面光滑。生理鹽水組紅細(xì)胞可粘附在血小板上、血小板形態(tài)不規(guī)律、體積增大、伸出偽足、聚集形血小板數(shù)增多。

表1 各組PAF誘導(dǎo)的血小板聚集結(jié)果比較（％，±s）

表1 各組PAF誘導(dǎo)的血小板聚集結(jié)果比較（％，±s）

與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組 別 n 給藥劑量 1 min 5 min MAX 血小板聚集抑制率生理鹽水組 8 0.00百裕低 8 39.21百裕中 8 39.18 2 mL 36.85±6.14 68.32±9.17 70.22±11.40 0.255 mL/kg 28.16±5.42**34.01±7.50**42.69±7.26**0.51 mL/kg 25.09±5.26**34.95±7.63**42.71±7.25**百裕高 8 43.76 1.02 mL/kg 24.42±5.04**30.84±7.22**39.49±7.38**

表2 加入PAF后各組血小板形態(tài)比較（％，±s）

表2 加入PAF后各組血小板形態(tài)比較（％，±s）

組 別 n 血小板形態(tài)圓形 樹形 展平形 聚集形生理鹽水組 8百裕低 8百裕中 8 3.2±0.8 7.5±2.4 11.8±3.2 77.5±18.5 33.5±12.6**18.8±8.3**36.2±14.4**11.5±3.3**34.8±12.1**22.2±8.0**33.9±11.5** 9.1±4.6**百裕高 8 40.7±15.3**10.5±6.0 18.7±7.8* 30.1±10.0**

2.3 各組血小板PF-4和β-TG檢測(cè)結(jié)果比較 見表3。與生理鹽水組相比，百裕銀杏內(nèi)酯高、中、低各劑量組PF-4水平顯著降低（P＜0.01），β-TG水平也顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明其血小板釋放功能受到抑制。

表3 血小板PF-4和β-TG檢測(cè)結(jié)果（μg/mL，±s）

表3 血小板PF-4和β-TG檢測(cè)結(jié)果（μg/mL，±s）

組 別 n PF-4 β-TG生理鹽水組 8 1.733±0.294 1.740±0.215百裕低 8 1.274±0.139** 1.236±0.170**百裕中 8 1.216±0.117** 1.204±0.165**百裕高 8 1.177±0.144** 1.129±0.158**

3 討論

白細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、肺、肝和腎等多種細(xì)胞和器官能產(chǎn)生一種內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)-PAF［2］。PAF可以作為炎癥介質(zhì)參與許多病理生理調(diào)節(jié)［3］；還能作為最強(qiáng)的內(nèi)源性血小板聚集劑，強(qiáng)烈地激活血小板，促進(jìn)血小板聚集［4］。PAF通過(guò)與靶細(xì)胞膜上的PAF受體結(jié)合而發(fā)揮作用［5］。PAF受體阻斷藥能阻止PAF與受體結(jié)合，因此對(duì)與PAF相關(guān)的疾病可能具有治療意義［6］。

銀杏葉提取物的主要成分是銀杏萜內(nèi)酯（GK），包括銀杏內(nèi)酯 A、B、C、J和 M（GKA、GKB、GKC、GKJ、GKM）等具有獨(dú)特的藥理作用和治療價(jià)值［7］。銀杏內(nèi)酯已被公認(rèn)為PAF受體拮抗劑，大量研究證實(shí)其具有拮抗炎癥介質(zhì)PAF的藥理作用［8］。GK可以拮抗PAF誘發(fā)的興奮性氨基酸（EAA）超常釋放［9］，還具有腦保護(hù)的治療效果，能修復(fù)由腦缺血引起的EAA和抑制性氨基酸（IAA）動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)［10］。在外源性D-Asp負(fù)載情況下，缺血再灌時(shí)大鼠海馬區(qū)的Ca2+依賴性PAF釋放也可以被GKB抑制［11］。

PF-4和β-TG均存在于血小板的α顆粒內(nèi)，同為血小板特異蛋白。在某種因素的刺激下，血小板被激活，能釋放出PF-4和β-TG［12］。當(dāng)血小板被激活時(shí)，β-TG表達(dá)增高，且β-TG/PF-4比率也升高；當(dāng)試管內(nèi)血小板被激活時(shí)，β-TG和PF-4的表達(dá)同時(shí)升高［13］。

百裕銀杏內(nèi)酯注射劑是一種新型的銀杏葉提取物相關(guān)產(chǎn)品，由白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯ABC組成，目前已在臨床大量使用，對(duì)心腦血管基本有較好的治療作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PAF作為血小板聚集劑而不是炎癥因子的時(shí)候，百裕銀杏內(nèi)酯注射劑能顯著地抑制PAF誘導(dǎo)的血小板聚集、改善血小板形態(tài)、抑制β-TG和PF-4的表達(dá)水平。說(shuō)明百裕銀杏內(nèi)酯注射劑是以PAF受體為靶點(diǎn)的抗血小板聚集劑，然而其臨床抗血小板聚集效果還需要臨床實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

［1］ Kuribara H，Weintraub ST，Yoshihama T.et al.An anxiolyticlike effect of Ginkgo biloba extract and its constituent，ginkgolide-A，in mice［J］.J Nat Prod，2003，66（10）：1333-1337.

［2］ Guerrero AT，Zarpelon AC，Vieira SM，et al.The role of PAF/PAFR signaling in zymosan-induced articular inflammatory hyperalgesia［J］.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2013，1（386）：51-59.

［3］Garland RC，Sun D，Zandi S，et al.Noninvasive molecular imaging revealsroleofPAFin 87［J］.2011，25（4）：1284-1294.

［4］ Stafforini DM，McIntyre TM.Determination of phospholipase activity of PAF acetylhydrolase［J］.Free Radic Biol Med，2013，59（5）：100-107.

［5］Melnikova VO，Villares GJ，Bar-Eli M.Emerging roles of PAR-1 and PAFR in melanoma metastasis［J］.Cancer Microenviron，2008，1（1）：103-111.

［6］ Sutovsky P，Plummer W，Baska K，et al.Relative levels of semen platelet activating factor-receptor（PAFr）and ubiquitin in yearling bulls with high content of semen white blood cells：implications for breeding soundness evaluation［J］.J Androl，2007，28（1）：92-108.

［7］Singh P，Singh IN，Mondal SC，et al.Platelet-activating factor（PAF）-antagonists of natural origin［J］.Fitoterapia，2013，84（6）：180-201.

［8］Liao HJ，Zheng YF，Li HY，et al.Two new ginkgolides from theleavesofGinkgobiloba［J］.PlantaMed，2011，16（77）：1818-1821.

［9］Kaminskaia GO，Abdullaev RIu，F(xiàn)ilippov VP.Biochemical characteristics of fluid and cells of bronchoalveolar washings in patients with extrinsic allergic alveolitis［J］.Probl Tuberk，2002，16（8）：26-30.

［10］Koch E.Inhibition of platelet activating factor （PAF）-induced aggregation of human thrombocytes by ginkgolides：considerations on possible bleeding complications after oral intake of Ginkgo biloba extracts［J］.Phytomedicine，2005，1（12）：10-16.

［11］Wang H，Qiu XY，Yang LS.Experimental research on effects of ginkgolides made in China on cerebral ischemia injury in rats［J］.Chin J Basic Med Tradit Chin Med（中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志），2002，8（6）：17-18.

［12］Kasperska-Zajac A，Brzoza Z，Rogala B.Increased concentration of platelet-derived chemokines in serum of patients with delayed pressure urticaria［J］.Eur Cytokine Netw，2008，19（2）：89-91.

［13］Kasperska-Zajac A，Brzoza Z，Rogala B.Effect of allergenspecific immunotherapy on plasma level of platelet factor 4（PF-4）and beta-thromboglobulin （beta-TG），platelet activation markers in patients with house dust mite allergy［J］. Vaccine，2007，18（25）：3595-3598.

The Effects of Bai Yu ginkgolide Injection on Platelet aggregation in rabbits

XU Lu，HUANG Yan. The Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology in Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

Aim：To observe the effects of Bai Yu ginkgolide injection on platelet aggregation，ultra structure and PF-4 and β-TG level in rabbits.Methods：Japanese big ear rabbits were randomly divided into Bai Yu ginkgolide Injection Low dose group，middle dose group，high dose group，and saline group，all of which were given corresponding treatment.In vivo experiments，when PAF induced platelet aggregation，platelet aggregation，ultra structure and PF-4 and β-TG level were observed.Results：Bai Yu ginkgolide injection could inhibit plate aggregation，reduce the number of aggregation type platelets and make fewer and shorter processes of dendritic platelets and reduce the level of PF-4 and β-TG significantly（P＜0.01）.Conclusion：Bai Yu ginkgolide injection could antagonism PAF-induced platelet aggregation，inhibit the activation of platelets，and is a kind of important anti platelet aggregation drug.

Bai Yu Ginkgolide Injection；Platelet；PAF；Electron Microscopy

1004-745X（2014）04-0638-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.04.031

重慶市中醫(yī)院院內(nèi)培育課題（2012-1-2-17）

△通信作者

2014-01-22）