李興林，趙 娜，韓廣建，曹雪飛

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

印楝有著悠久的藥用價(jià)值和農(nóng)業(yè)化學(xué)應(yīng)用價(jià)值[1]．印楝代謝物具有殺蟲、拒食、趨避、毒殺和引起昆蟲不孕不育等顯著特性，且有高效、無毒、易降解、環(huán)保等優(yōu)勢，使其成為國際上最重要的農(nóng)藥資源植物之一[1–2]．比較印楝組織和器官中的活性成分發(fā)現(xiàn)，印楝素 A的殺蟲效果最為顯著[3–4]．印楝素是一類檸檬苦素類三萜化合物，對上百種害蟲有殺蟲活性、拒食性、生長規(guī)律可調(diào)節(jié)性等突出特點(diǎn)[5]．印楝細(xì)胞、組織和器官等提取物中除印楝素外，還存在其他抗蟲活性的檸檬苦素類似物[6–7]，且新的活性物質(zhì)的種類在不斷增加．甚至有些不含印楝素的印楝提取物也具有較好的殺蟲效果，這將為印楝提取液混合物直接應(yīng)用于控蟲制劑生產(chǎn)提供了依據(jù)．

印楝素的含量在印楝的種子中最高[8–9]，因此，生產(chǎn)上常以種子為提取原料．印楝素的提取方法主要有微波法、超聲波法、快速萃取法和常規(guī)浸提法等，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)[10–11]．

然而，以種子為原料提取印楝素存在著諸多問題：印楝品種、種植區(qū)地理環(huán)境等差異，導(dǎo)致收獲種子的印楝素含量也存在著很大的差異，影響了印楝制劑的質(zhì)量及其穩(wěn)定性[2]；印楝種子油脂的處理工藝差異也將對印楝素的提取產(chǎn)生較大影響[12–13]；更為重要的是，在印楝種子貯藏過程中，隨著時(shí)間的延長其有效成分將快速下降，而使用印楝殺蟲劑又存在著明顯的季節(jié)性，因而利用種子生產(chǎn)和貯藏印楝制劑有較大的局限性．復(fù)雜的印楝素分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)致它的化學(xué)合成途徑一直未能取得突破，使得印楝素成為一種高成本、緊缺的生化試劑[14–15]．因而，通過植物組織培養(yǎng)方法從印楝培養(yǎng)物中制備印楝素日益受到關(guān)注，但是，其培養(yǎng)物的控蟲效果究竟如何卻鮮有報(bào)道[16]. 本文通過印楝的愈傷組織、懸浮培養(yǎng)物和懸浮培養(yǎng)物細(xì)胞3種浸提液對黃粉蟲幼蟲的處理，以印楝素農(nóng)藥為對照，評估它們在不同時(shí)間的殺蟲、拒食、趨避等方面的效果，為開發(fā)印楝培養(yǎng)物抗蟲制劑提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 印楝幼苗的制備

取無病蟲害的印楝種子若干，在敲除堅(jiān)硬的果殼后，將果仁浸沒在洗衣粉溶液(每千克水加 1～2,g洗衣粉)中 1,h；在自來水反復(fù)清洗后，將其平鋪于透氣籃中，上面覆蓋濕潤紗布，定期換濕布；在室溫下萌發(fā)30,d；取正常生長的幼苗移栽到培土盆中室外光照培養(yǎng)．

1.2 印楝愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)

種子萌發(fā)30,d后，剪取少量幼葉，用洗衣粉溶液洗滌，自來水沖洗 4～5,h，2% NaClO 消毒 5,min，無菌水沖洗 3次；再用體積分?jǐn)?shù) 75%乙醇浸泡 30,s，無菌水沖洗 3次，無菌濾紙擦干葉片[17]；再將葉片切成約 0.5,cm2的碎片，分別接種到已滅菌的含有 3%蔗糖、0.65%瓊脂、3.0,mg/L NAA(α–萘乙酸)、1.0,mg/L 6-BA(6–芐氨基腺嘌呤)、pH 5.8的 MS培養(yǎng)基上，(25±2)℃暗培養(yǎng) 24,h[17–18]．每隔 4周對愈傷組織在相同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件上繼代培養(yǎng)1次，直至形成松散型愈傷組織為止．

1.3 懸浮細(xì)胞的制備及其繼代培養(yǎng)

將易分散的愈傷組織以 2%的接種量接種到含有3.0,mg/L NAA、1.5,mg/L 6-BA 的 50,mL MS 液體培養(yǎng)基中(250,mL三角瓶)；在125,r/min回轉(zhuǎn)搖床上振蕩培養(yǎng)，溫度、光/暗周期分別為 25,℃和 16,h/8,h[19]；培養(yǎng) 10,d后，將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到同種的新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，直至形成分散良好、呈現(xiàn)渾濁的懸浮細(xì)胞系為止．

1.4 印楝素A含量的測定

1.4.1 印楝素A樣品溶液的制備

精確稱取干燥至恒質(zhì)量的樣品5.0,mg，用二氯甲烷溶解，定容至 50,mL，配制成 0.1,mg/mL的樣品溶液．

1.4.2 印楝素A最大吸收峰的確定

精確吸取樣品溶液1.4,mL，加入0.02,g/mL香草醛甲醇溶液 0.4,mL，振蕩混合均勻；室溫放置 2,min后，分3次加入0.6,mL濃硫酸，每次加入后迅速振蕩10,s，再加入 1.4,mL的甲醇溶液．以二氯甲烷作為空白對照，靜置 10,min后于 400～600,nm 波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在579,nm處呈現(xiàn)最大吸收峰．

1.4.3 印楝素A含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別取 0.0、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.4,mL 標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)溶液置于7支10,mL試管中，用二氯甲烷分別定容到1.4,mL；加入0.02,g/mL香草醛甲醇溶液 0.4,mL，振蕩混合均勻；室溫放置 2,min后，分 3次加入0.6,mL濃硫酸，每次加入后迅速振蕩10,s，再加入1.4,mL的甲醇溶液；靜置10,min后在紫外可見分光光度計(jì)測定其在 579,nm處的吸光度．以吸光度對印楝素 A質(zhì)量濃度作回歸處理，得到回歸方程(y＝0.006,9,x-0.118,7，R2＝0.993,7)；依據(jù)回歸方程可計(jì)算待測溶液中的印楝素A含量．

1.4.4 印楝愈傷組織中印楝素A含量的測定

將印楝愈傷組織在 50,℃下烘干至恒質(zhì)量；稱取樣品0.15,g(干質(zhì)量)，用10,mL CH3OH浸泡過夜，超聲提取 2次，每次 30,min，按體積比為 60∶40的比例把水加到甲醇里，再用 10,mL 二氯甲烷萃取該甲醇溶液清洗 2次(濃度同上)；合并二氯甲烷溶液，40,℃真空旋干，再用 5,mL二氯甲烷重溶獲得樣液待用．

取 1.4,mL樣液于試管中，加入 0.02,g/mL香草醛甲醇溶液0.4,mL，振蕩混勻，室溫靜置2,min；然后分 3次加入 0.6,mL濃硫酸，每次加入后迅速振蕩10,s；再加入 1.4,mL的甲醇溶液，以二氯甲烷作為空白對照，測定吸光度．由回歸方程計(jì)算樣品溶液中印楝素A含量．

1.4.5 印楝懸浮細(xì)胞內(nèi)印楝素A含量的測定

將懸浮細(xì)胞液以3,000,r/min的轉(zhuǎn)速離心10,min，取上清液，備用；用重蒸水洗滌細(xì)胞 2次，50,℃烘干細(xì)胞至恒質(zhì)量．測定上清液以及懸浮細(xì)胞內(nèi)的印楝素A含量的步驟均與1.4.4節(jié)相同．

1.4.6 印楝懸浮培養(yǎng)物印楝素A含量的測定

搖瓶懸浮液直接用超聲波破碎(20,kHz，20～30,min)，然后準(zhǔn)確移取 1.4,mL樣液于試管中，按1.4.4節(jié)的步驟測定其印楝素A含量．

1.5 印楝素乳油(0.3%)農(nóng)藥對黃粉蟲幼蟲的有效作用濃度

0.3%印楝素乳油農(nóng)藥(海南利蒙特生物農(nóng)藥有限公司)100,mL．按該農(nóng)藥的使用說明書要求，在稀釋700倍后可應(yīng)用于菜青蟲等害蟲的防治，但還沒有黃粉蟲的相關(guān)殺蟲濃度記載．為了了解該農(nóng)藥制劑對黃粉蟲幼蟲的有效作用濃度，將其用蒸餾水分別稀釋成 1、100、300、500和700倍溶液；然后分別取2,mL混合于2,g麥麩中，再放入30條3齡(每正常蛻皮1次為1齡)黃粉蟲幼蟲；在第0、3、6和9天時(shí)測定蟲質(zhì)量和麥麩質(zhì)量等，以確定其對黃粉蟲幼蟲的有效作用的濃度和開始發(fā)揮顯著作用的時(shí)間[20]．

1.6 對照與實(shí)驗(yàn)組工作液的設(shè)置

陰性對照：二氯甲烷溶液；陽性對照：在1.5節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以有效作用濃度的制劑確定為陽性對照；以陽性對照印楝素A的濃度為參照，將不同培養(yǎng)物浸提液稀釋成相同印楝素 A濃度的工作液，以利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較，浸提液 1為愈傷組織浸提液，浸提液2為懸浮培養(yǎng)物浸提液，浸提液3為懸浮培養(yǎng)物細(xì)胞浸提液．

1.7 毒理實(shí)驗(yàn)

均含0.003%印楝素A的陽性對照和3組實(shí)驗(yàn)工作液以及不含印楝素 A的陰性對照分別按體積質(zhì)量比為 1∶1浸泡麥麩，然后置于通風(fēng)性好的低溫黑暗處放置過夜后備用．

1.7.1 觸殺性處理

瞬間浸泡法：將黃粉蟲幼蟲在工作液中瞬間浸泡2,s，然后放入沒有進(jìn)行藥劑處理的麥麩中喂養(yǎng)，分別在第3、6、9和12天后觀察黃粉蟲的死亡情況，并計(jì)算致死率，對照組為二氯甲烷．每組 3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30條3齡大小一致的幼蟲．致死率和校正致死率分別按照式(1)和式(2)計(jì)算．

1.7.2 拒食性處理

采用隨機(jī)喂養(yǎng)的生物實(shí)驗(yàn)方法[20]，實(shí)驗(yàn)前對 3齡黃粉蟲幼蟲進(jìn)行分組處理和隔夜 16,h饑餓處理．然后用麥麩和新鮮蔬菜喂飽(停止進(jìn)食開始休息時(shí)即為吃飽，大約 15,min)，再進(jìn)行 3,h饑餓處理，然后用以上處理的麥麩喂食，每組 2,g，對照組用二氯甲烷處理麥麩，分別在第 3、6和 9天后稱量麥麩的質(zhì)量差即飼料減少量m，并計(jì)算拒食率．每組3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù) 30條 3齡大小一致的幼蟲．拒食率按式(3)計(jì)算．

1.7.3 趨避性處理

稱取相同質(zhì)量的藥劑處理的麥麩和二氯甲烷溶液處理的麥麩，分別均勻放入培養(yǎng)皿的兩邊，中間留有2,cm寬的空間，防止黃粉蟲幼蟲．分別在3、6、9,d后記錄培養(yǎng)皿中實(shí)驗(yàn)與對照組兩邊的黃粉蟲的蟲口數(shù)，并計(jì)算其趨避率．每組3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30條3齡大小一致的幼蟲．趨避率按式(4)計(jì)算．

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并以陰性對照或陽性對照為比較對象，分別同另一對照以及實(shí)驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果作顯著性統(tǒng)計(jì)分析．

2 結(jié)果與討論

2.1 印楝素乳油(0.3%)農(nóng)藥制劑的黃粉蟲幼蟲有效濃度確定

在菜青蟲等害蟲防治的使用說明中，0.3%印楝素乳油農(nóng)藥可以稀釋700倍使用，但針對黃粉蟲幼蟲的有效處理濃度，還沒有加以說明和相關(guān)的報(bào)道．將0.3%印楝素乳油制劑分別稀釋 1、100、300、500和700倍后處理幼蟲，并統(tǒng)計(jì)其校正致死率．圖1顯示，死亡的幼蟲蟲體局部有環(huán)狀黑斑(圖中箭頭為幼蟲的黑斑處)出現(xiàn)，以其可以辨別蟲體的死活．圖2顯示，在稀釋 100倍時(shí)，第 9天的幼蟲校正致死率約為50%，而在稀釋700倍時(shí)為10%以下．因此，采用稀釋100倍的制劑作為陽性對照用藥，以此確定印楝素 A的工作濃度為0.003%；3種印楝培養(yǎng)物浸提液在測定其印楝素含量后，用二氯甲烷分別將其稀釋成印楝素含量為0.003%的工作液．

圖2 不同稀釋倍數(shù)的印楝素乳油農(nóng)藥對黃粉蟲幼蟲校正致死率的影響(第9天)Fig.2 Effect of different dilutions of azadirachtinEC on the correction mortality of Tenebrio molitor larvae(on the 9th day)

2.2 不同培養(yǎng)物浸提液對黃粉蟲幼蟲校正致死率的影響

不同培養(yǎng)物浸提液對黃粉蟲幼蟲校正致死率的影響結(jié)果見表1．

表1 不同培養(yǎng)物浸提液對黃粉蟲幼蟲校正致死率的影響(n＝3)Tab.1 Effect of different extracts on the adjusted lethal rate of Tenebrio molitor larvae(n＝3)

由表1可知：浸提液3即懸浮培養(yǎng)物細(xì)胞浸提液的幼蟲致死率最高，但仍然明顯低于印楝素農(nóng)藥；浸提液 1即愈傷組織浸提液的效果最差．由此表明，3種培養(yǎng)物中除印楝素外，還有其他殺蟲成分發(fā)揮作用，且存在著組織、細(xì)胞內(nèi)外等分布上的差異．

2.3 不同培養(yǎng)物浸提液對黃粉蟲幼蟲質(zhì)量的影響

不同培養(yǎng)物浸提液對黃粉蟲幼蟲質(zhì)量的影響結(jié)果見表 2．陰性對照表明，0～9,d時(shí)幼蟲的質(zhì)量不斷增加；經(jīng)印楝素農(nóng)藥處理后，幼蟲質(zhì)量持續(xù)下降；而經(jīng)印楝培養(yǎng)物浸提液處理，幼蟲質(zhì)量先升高，后下降，第 9天，與陰性對照相比，達(dá)到了極顯著差異水平．其中，浸提液 2即懸浮培養(yǎng)物浸提液的影響效果較其他兩種浸提液有所延后．由此表明，培養(yǎng)物浸提液顯著影響黃粉蟲幼蟲的生長．

表2 不同培養(yǎng)物浸提液對黃粉蟲幼蟲質(zhì)量的影響(n＝3)Tab.2 Effect of different extracts on the body weight of Tenebrio molitor larvae(n＝3)

2.4 不同培養(yǎng)物浸提液對黃粉蟲幼蟲拒食率的影響

黃粉蟲幼蟲拒食率的結(jié)果見表3．由表3可知：3種培養(yǎng)物浸提液處理幼蟲后，其拒食率均有顯著提高，其中浸提液1和浸提液3即愈傷組織浸提液和懸浮培養(yǎng)物細(xì)胞浸提液的效果達(dá)到或超過印楝素農(nóng)藥的陽性對照組．高拒食率導(dǎo)致幼蟲的食量下降也是幼蟲質(zhì)量下降的主要因素之一，在實(shí)際使用中具有重要價(jià)值．

表3 不同培養(yǎng)物浸提液對黃粉蟲幼蟲拒食率的影響(n＝3)Tab.3 Effect of different extracts on the antifeeding rate of Tenebrio molitor larvae(n＝3)

2.5 不同培養(yǎng)物浸提液對黃粉蟲幼蟲趨避率的影響分別應(yīng)用對照液和 3種印楝培養(yǎng)物浸提液處理

幼蟲的食源，幼蟲在短期選擇中趨向明顯，但時(shí)間較長后，這種趨勢明顯減弱．表 4僅列出了前 2,d的統(tǒng)計(jì)結(jié)果．由表4可知，3種培養(yǎng)物浸提液在24,h內(nèi)的幼蟲趨避率最好，達(dá)到陽性對照的水平，但隨后的趨避率明顯下降，其中，浸提液1和浸提液2即愈傷組織浸提液和懸浮培養(yǎng)物浸提液在48,h后最為明顯．

表4 不同培養(yǎng)物浸提液對黃粉蟲幼蟲趨避率的影響(n＝3)Tab.4 Effect of different extracts on the repellent rate of Tenebrio molitor larvae(n＝3)

3 結(jié) 論

愈傷組織浸提液、懸浮培養(yǎng)物浸提液和懸浮培養(yǎng)物細(xì)胞浸提液在幼蟲質(zhì)量、拒食率和趨避率等方面達(dá)到或超過印楝素農(nóng)藥的控蟲效果，但在致死率方面三者表現(xiàn)較印楝素乳劑農(nóng)藥差．印楝培養(yǎng)物的 3種浸提液之間在控蟲的各項(xiàng)指標(biāo)上也存在著一定的差異，可能因?yàn)樗鼈兊挠行С煞旨捌浜可嫌兴煌鴮?dǎo)致控蟲結(jié)果的差異，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究．綜上所述，通過組織、細(xì)胞途徑獲得的培養(yǎng)物經(jīng)過一步浸提后可直接生產(chǎn)低成本的殺蟲劑原料．

［1］ Chaturvedi R，Razdan M K，Bhojwani S S. Production of haploids of neem(Azadirachta indica A. Juss. )by anther culture[J]. Plant Cell Reports，2003，21(6)：531–537.

［2］ Govindachari T R，Gopalakrishnan G，Suresh G. Triterpenoidal constituents of an aqueous extract from neem kernels[J]. Fitoterapia，1999，70(6)：558–560.

［3］ Sanderson K. Chemists synthesize a natural-born killer[J]. Nature，2007，448(7154)：630–631.

［4］ Thengane S，Joshi M，Mascarenhas A F. Somatic embryo genesis in neem(Azadirachta indica)[J]. Forestry Sciences，1995，44/45/46：357–374.

［5］ Prakash G，Emmannuel C J S K，Srivastava A K. Variability of azadirachtin in Azadirachta indica neem and batch kinetics studies of cell suspension culture[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering，2005，10(3)：198–204.

［6］ Dai J，Yaylayan V A，Raghavan G S，et al. Extraction and colorimetric determination of azadirachtin-related limonoids in neem seed kernel[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry，1999，47(9)：3738–3742.

［7］ Jadeja G C，Maheshwari R C，Naik S N. Extraction of natural insecticide azadirachtin from neem(Azadirachta indica A. Juss)seed kernels using pressurized hot solvent[J]. The Journal of Supercritical Fluids，2011 ，56(3)：253–258.

［8］ Sujanya S，Devi B P，Sai I. In vitro production of azadirachtin from cell suspension cultures of Azadirachta indica[J]. Journal of Biosciences，2008，33(1)：13–20.

［9］ Prakash G，Srivastava A K. Statistical elicitor optimization studies for the enhancement of azadirachtin production in bioreactor Azadirachta indica cell cultivation[J].Biochemical Engineering Journal，2008，40(2)：218–226.

［10］ 段瓊芬，王有瓊，孫龍，等. 4種提取印楝素方法的比較[J]. 農(nóng)藥，2005，44(10)：455–456，459.

［11］ 楊軍，羅喜榮，范菊娣，等. 罐組式動態(tài)逆流提取印楝素的工藝[J]. 農(nóng)藥，2010，49(6)：413–415.

［12］ Johnson S，Morgan E D. Supercritical fluid extraction of oil and triterpenoids from neem seeds[J]. Phytochemical Analysis，1997，8(5)：228–232.

［13］ Dai J M，Yaylayan V A，Raghavan G S V，et al. Influence of operating parameters on the use of the microwaveassisted process(MAP)for the extraction of azadirachtinrelated limonoids from neem(Azadirachta indica)under atmospheric pressure conditions[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49(10)：4584–4588.

［14］ Tonthubthimthong P，Chuaprasert S，Douglas P，et al.Supercritical CO2extraction of nimbin from neem seedsan experimental study[J]. Journal of Food Engineering，2001，47(4)：289–293.

［15］ Kearney M L，Allan E J，Hooker E J，et al. Antifeedant effects of in vitro culture extracts of the neem tree，Azadirachta indica against the desert locust(Schistocerca gregaria(Forsk?l))[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1994，37(1)：67–71.

［16］ 梁軍，魏剛，呂全，等. 印楝細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的建立及懸浮培養(yǎng)[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，2003，16(5)：568–574.

［17］ Singh M，Chaturvedi R. Statistical optimization of media for enhanced azadirachtin production from redifferentiated zygotic embryo cultures of neem(Azadirachta indica A. Juss. )[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2012，48(1)：92–98.

［18］ Murashige T，Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue culture[J].Physiologia Plantarum，1962，15(3)：473–497.

［19］ Prakash G，Srivastava A K. Statistical media optimization for cell growth and azadirachtin production in Azadirachta indica(A. Juss)suspension cultures[J].Process Biochemistry，2005，40(12)：3795–3800.

［20］ Lewis A C，Van Emden H F. Assays for insect feeding[M]. New York：Insect-Plant Interactions，1986：95–119.