王雅娟，趙一婷，戴 斌，湯慧芳，蔣雅麗，汪雪峰，5，陳季強(qiáng)

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，其臨床的典型特征有氣道炎癥、氣道重塑及氣道高反應(yīng)性。目前，用來(lái)制備支氣管哮喘模型用于實(shí)驗(yàn)研究的動(dòng)物有很多，包括大鼠、小鼠、豚鼠等，其中豚鼠由于其過敏反應(yīng)易于激發(fā)，且與人類相近成為最為常見的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。但使用豚鼠復(fù)制哮喘模型的缺點(diǎn)在于個(gè)體差異較大、難飼養(yǎng)、激發(fā)時(shí)死亡率高，并且用于檢測(cè)的相應(yīng)的分子生物學(xué)材料少見，獲取比較困難。因此，近年來(lái)研究人員更傾向于采用大鼠制作哮喘模型。大鼠來(lái)源廣、繁殖快，激發(fā)后能產(chǎn)生和人類較為相似的過敏反應(yīng)，且死亡率較豚鼠低，并且用于檢測(cè)的分子生物學(xué)試劑常見，作為復(fù)制哮喘模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。其中，SD大鼠的應(yīng)用約占到使用頻率的60%左右［1－3］。

目前，常用于復(fù)制大鼠哮喘模型的方法是用10%的氫氧化鋁凝膠作為佐劑，將卵白蛋白（ovalbumin，OVA）溶于佐劑制成致敏用溶劑，于腹腔或多點(diǎn)皮下注射致敏大鼠，再以O(shè)VA的生理鹽水溶液進(jìn)行霧化攻擊復(fù)制哮喘大鼠模型［4～6］。另有報(bào)道，使用OVA氫氧化鋁凝膠溶液腹腔注射與百日咳桿菌（pertussis）肌內(nèi)注射共同致敏，再以O(shè)VA的生理鹽水溶液進(jìn)行霧化攻擊造成的大鼠哮喘模型［2，7～13］，這種新方法與傳統(tǒng)的OVA單獨(dú)致敏有何區(qū)別？百日咳桿菌加強(qiáng)致敏是否能增加模型復(fù)制的成功率？百日咳桿菌單獨(dú)致敏和OVA有區(qū)別嗎？為了解決這些問題，找到一種更為成功的造模方法，我們分別使用了OVA單獨(dú)致敏、pertussis單獨(dú)致敏和OVA＋pertussis共同致敏這3種方法致敏大鼠，再進(jìn)行OVA生理鹽水溶液霧化攻擊，觀察以上3種致敏方法所復(fù)制的大鼠哮喘模型的差別。

1 材料與方法

1.1 試劑 卵白蛋白（美國(guó)Sigma產(chǎn)品）；百日咳桿菌（購(gòu)自上海生物制品研究所）；氨甲酰膽堿（Methacholine，MCh，Sigma公司，批號(hào)：79H1505）；其余所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley大鼠，清潔級(jí)，♂，160～180 g，由上海西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：Scxk（滬）2008-0016。

1.3 儀器 霧化吸入器（BARI，MASTER，Germany）；Medlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)（V5.0，南京美易公司）；磁力攪拌器（JB-4，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；冷凍離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge 5840R，Germany）；顯微鏡（Olympus BX51，Japan）。

1.4 動(dòng)物處理 大鼠分為4組，每組12只：①正常對(duì)照組；②OVA單獨(dú)致敏組；③ pertussis單獨(dú)致敏組；④OVA＋pertussis共同致敏組。致敏用OVA溶液是將OVA溶于新鮮配制的10%氫氧化鋁凝膠內(nèi)，充分?jǐn)嚢杌靹颍琌VA的終濃度為0.2%。OVA致敏方法采用的是本課題組傳統(tǒng)的十點(diǎn)致敏法［10］，包括兩前后足趾4點(diǎn)，兩側(cè)腹股溝2點(diǎn)，頸部1點(diǎn)，背部左、中、右3點(diǎn)，每點(diǎn)皮下注射0.05 ml OVA凝膠，另腹腔注射0.5 ml OVA凝膠，OVA致敏總體積為1 ml／鼠。致敏用百日咳桿菌溶液以生理鹽水配至1011個(gè)／ml，肌內(nèi)注射0.2 ml，終濃度為2×1010／鼠，d 0對(duì)各模型組大鼠分別按分組組別致敏。致敏d 14開始，用1%的OVA生理鹽水溶液霧化（德國(guó)Master超聲霧化器，1～5μm partical）吸入30 min進(jìn)行攻擊，持續(xù)7 d。

1．5 支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)致敏大鼠末次攻擊后24 h，股動(dòng)脈放血處死。行氣管插管，用D-Hank’s液5 ml分3次進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，反復(fù)抽打，回收BALF，回收率達(dá)95%。以1∶3比例加入白細(xì)胞計(jì)數(shù)液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)，再以1 500 r·min－1離心10 min，棄去上清液，取20μl沉淀涂片，HE染色后進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1．6 致敏大鼠MCh的氣道反應(yīng)性的測(cè)定 致敏大鼠末次攻擊24 h后，用25%烏拉坦4.0 ml·kg－1腹腔注射麻醉大鼠，行氣管插管后，將大鼠置于密閉的自制身體容積描記箱內(nèi)。用Medlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄儀，記錄麻醉大鼠霧化吸入MCh前、后氣道流速、跨肺壓、潮氣量。實(shí)驗(yàn)時(shí)吸入的MCh由超聲霧化器霧化，吸入濃度依次為0.4、0.8、1.6、4.0、和 8.0 g·L－1，每一濃度霧化吸入 20 s，間隔 5～10 min后吸入下一個(gè)濃度，觀察并記錄吸入后5 min內(nèi)氣道流速、跨肺壓、潮氣量的變化。氣道阻力以跨肺壓與呼吸氣道流速之比計(jì)算，單位為cmH2O·s·ml－1。肺順應(yīng)性以平均潮氣量與平均跨肺壓之比計(jì)算，單位為ml·cmH2O－1。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果以ˉx±s表示，采用Sigma Stat軟件包統(tǒng)計(jì)，以one-way ANOVA和t檢驗(yàn)作差異的顯著性分析。

2 結(jié)果

2．1 不同致敏方法對(duì)大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)的影響 由Tab 1、Tab 2可見，OVA＋pertussis共同致敏并攻擊組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)升高最明顯，與正常對(duì)照組比較差異有顯著性（P＜0.01），并且其中嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的計(jì)數(shù)均較正常對(duì)照組明顯增高（P＜0.05）；OVA單獨(dú)致敏并攻擊組大鼠BALF中的白細(xì)胞總數(shù)也明顯增高，其中嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的數(shù)量和正常對(duì)照組相比均明顯升高（P＜0.01）；pertussis單獨(dú)致敏并攻擊對(duì)大鼠BALF中的白細(xì)胞總數(shù)無(wú)明顯影響，卻可明顯增加嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量（P＜0.05），但這一增加作用較OVA單獨(dú)致敏和OVA＋pertussis共同致敏并攻擊組微弱很多，對(duì)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞無(wú)明顯影響。

Tab 1 Total inflammatory cells in bronchoalvelar fluid in OVA＋pertussis sensitized，OVA sensitized and pertussis sensitized rats（ˉx±s，n＝6）

2.2 不同致敏方法對(duì)大鼠氣道高反應(yīng)性的影響 由Fig 1可見，OVA＋pertussis共同致敏并攻擊組大鼠對(duì)MCh的反應(yīng)性明顯增強(qiáng)，在1.6、4.0、8.0 g·L－1濃度的 MCh霧化吸入刺激時(shí)，氣道阻力明顯增加，在 0.8、1.6、4.0、8.0 g·L－1濃度的MCh霧化吸入刺激時(shí)，肺順應(yīng)性明顯降低，與正常組相比差異有顯著性（P＜0.05）。OVA單獨(dú)致敏在4.0、8.0 g·L－1濃度的MCh霧化吸入刺激時(shí)，可使氣道阻力明顯增加，肺順應(yīng)性明顯降低（P＜0.05），pertussis單獨(dú)致敏在8.0 g·L－1濃度的MCh霧化吸入刺激時(shí)，可使氣道阻力明顯增加，肺順應(yīng)性明顯降低（P＜0.05）。

Fig 1 Methacholine-induced increase of lung resistance（RL）and decrease of lung compliance（Cdyn）in OVA＋pertussis sensitized，OVA sensitized and pertussis sensitized rats（ˉx±s，n＝6）

2．3 不同致敏方法對(duì)大鼠肺組織HE染色的影響 由Fig 2可見，正常對(duì)照組大鼠氣道壁及肺泡結(jié)構(gòu)正常，氣管黏膜上皮完整，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。OVA＋pertussis共同致敏并攻擊組大鼠氣道周圍及肺間質(zhì)可見有大量嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，且支氣管管壁及平滑肌增厚、管腔狹窄，與正常對(duì)照組相比差異明顯。OVA單獨(dú)致敏并攻擊組氣道周圍及肺間質(zhì)也可見大量嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，但淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)不如OVA＋pertussis共同致敏并攻擊組明顯。pertussis單獨(dú)致敏組大鼠氣道周圍也有部分炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但數(shù)量較OVA＋pertussis共同致敏組和OVA單獨(dú)致敏組少很多，且少見嗜酸性粒細(xì)胞。

Tab 2 Antigen-induced lung inflammatory cells in bronchoalvelar fluid in OVA＋pertussis sensitized，OVA sensitized and pertussis sensitized rats（ˉx±s，n＝6）

Fig 2 Histological pathology detection in lung tissues of rats（HE stain，×400）

3 討論

近年來(lái)，由于環(huán)境污染及社會(huì)因素，哮喘發(fā)病率大大提升，尤其是兒童哮喘的發(fā)病率逐年上升［14－15］，這已經(jīng)引起了人們的普遍關(guān)注，如何緩解哮喘的慢性炎癥并減少其急性發(fā)作是目前研究的重點(diǎn)。而一個(gè)成功穩(wěn)定的哮喘動(dòng)物模型在研究哮喘中至關(guān)重要。大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用于哮喘模型的復(fù)制有著獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如哮喘的發(fā)生特點(diǎn)許多和人類相似，其過敏反應(yīng)也由IgE介導(dǎo)，產(chǎn)生的氣道高反應(yīng)性持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，激發(fā)后和人類一樣呈現(xiàn)速發(fā)性與遲發(fā)性雙相反應(yīng)［3］，并且遲發(fā)反應(yīng)的出現(xiàn)時(shí)間約為激發(fā)后4～8 h，這與哮喘患者出現(xiàn)遲發(fā)性反應(yīng)時(shí)間非常接近。這些特點(diǎn)都使得大鼠成為目前哮喘的研究中越來(lái)越常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

一個(gè)成功穩(wěn)定的動(dòng)物模型對(duì)于研究哮喘至關(guān)重要，本研究通過使用OVA和pertussis各自單獨(dú)使用，或二者共同使用3種方法對(duì)大鼠進(jìn)行致敏，再用OVA的生理鹽水溶液進(jìn)行霧化攻擊制備哮喘模型，從支氣管肺泡的炎癥浸潤(rùn)情況、氣道高反應(yīng)性的發(fā)生情況及肺部病理變化方面，觀察模型的成功性。結(jié)果顯示，OVA單獨(dú)致敏和OVA＋pertussis共同致敏都可明顯增加大鼠支氣管肺泡灌洗液中的白細(xì)胞數(shù)量，而pertussis單獨(dú)致敏則對(duì)白細(xì)胞數(shù)量影響較小。我們使用細(xì)胞涂片染色進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，OVA單獨(dú)致敏和OVA＋pertussis共同致敏都可明顯增加支氣管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的數(shù)量，而pertussis單獨(dú)致敏僅對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量有較弱影響，且對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量的增加作用與OVA致敏組相比極其微弱。眾所周知，嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是哮喘發(fā)病中的關(guān)鍵因素，哮喘的急性發(fā)作和慢性氣道炎癥伴隨著嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的大量浸潤(rùn)和聚集。因此，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明pertussis可在復(fù)制哮喘動(dòng)物模型中起到加強(qiáng)致敏以增加造模的成功率的作用，但是，單用用于致敏不能復(fù)制成功的哮喘動(dòng)物模型。氣道高反應(yīng)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OVA＋pertussis共同致敏、OVA單獨(dú)致敏和pertussis單獨(dú)致敏都可一定程度的增加大鼠的肺阻力，并降低其肺順應(yīng)性，但二者共同致敏并攻擊組對(duì)氣道高反應(yīng)性的影響效果明顯大于OVA單獨(dú)致敏組和pertussis單獨(dú)致敏組。肺組織HE染色結(jié)果顯示，OVA＋pertussis共同致敏并攻擊組大鼠氣道周圍有大量的嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，提示模型成功；OVA單獨(dú)致敏組也可明顯增加氣道周圍嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量，但效果不如二者共同致敏并攻擊組明顯；pertussis單獨(dú)致敏組淋巴細(xì)胞數(shù)量和正常對(duì)照組相比有明顯的增加，但是氣道周圍嗜酸性粒細(xì)胞的增加不明顯，而嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)恰恰是引起哮喘的關(guān)鍵炎癥細(xì)胞。由此我們推斷，OVA在復(fù)制哮喘動(dòng)物模型的致敏環(huán)節(jié)中必不可少，可作為外來(lái)抗原引起動(dòng)物的免疫炎癥反應(yīng)。百日咳桿菌在致敏中可起到輔助和加強(qiáng)致敏的作用，但是單用不能引起大鼠明顯的氣道炎癥。

綜合以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們得出結(jié)論，OVA是復(fù)制大鼠哮喘模型中的必不可少的致敏物質(zhì)，其與pertussis合用用于致敏效果優(yōu)于單獨(dú)使用的致敏效果。因此，OVA和pertussis共同致敏，并用OVA霧化攻擊是一種較為成功的復(fù)制大鼠哮喘模型的方法。

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