不同pH值對(duì)人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞MRC-5生長(zhǎng)的影響

陳通威，趙 鵬(山西康寶生物制品股份有限公司，長(zhǎng)治 046011;通訊作者，E-mail:ctw001@126.com)

細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)以及分子生物學(xué)是現(xiàn)代生物學(xué)三大前沿學(xué)科，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域中最常用的方法之一。尤其是在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，許多基因工程藥物、疫苗等都離不開最基本的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，人二倍體細(xì)胞系的建立使人用疫苗得到了長(zhǎng)足的發(fā)展［1］。目前，人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞(MRC-5)被國(guó)內(nèi)外很多科研單位和細(xì)胞培養(yǎng)工作者使用［2，3］。

在體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)液的pH值過(guò)高或過(guò)低均會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響。戴永祥等曾經(jīng)報(bào)道過(guò) MRC-5 生長(zhǎng)適宜的 pH 值為 7.4［4］，本文對(duì)MRC-5的生長(zhǎng)pH值范圍進(jìn)行了擴(kuò)展研究，找出了適宜MRC-5細(xì)胞生長(zhǎng)的最佳pH值范圍。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞代謝產(chǎn)物的積累會(huì)改變培養(yǎng)液的pH值，故常用緩沖液或二氧化碳調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)液pH值，本文使用7.5%的碳酸氫鈉溶液來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)液的pH值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞(MRC-5)，購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)，經(jīng)自行建庫(kù)后備用，51萬(wàn)個(gè)/ml。

1.1.2 主要設(shè)備、器材與試劑 生化培養(yǎng)箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司。pH計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。倒置顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司。超凈工作臺(tái)，北京西泰科隆儀器技術(shù)有限公司。數(shù)顯恒溫三用水箱，金壇科興儀器廠。高溫電子滅菌爐，SANYO。高壓蒸汽滅菌器，SANYO。滲透儀，WESCOR。T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，Nucn。細(xì)胞計(jì)數(shù)板，玉環(huán)縣求精醫(yī)用儀器廠。

硫酸慶大霉素，4萬(wàn) U/ml，天津藥業(yè)。MEM，0.95%，GIBCO。胎牛血清，民海生物。谷氨酰胺，高級(jí)純，Amresco;配置成0.2 mol/L溶液。胰酶，1∶250，BD;配置成 0.25%溶液。NaHCO3，AR，國(guó)藥集團(tuán);配置成7.5%溶液。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)液配制 MEM細(xì)胞培養(yǎng)液的配制:MEM 935 ml，胎牛血清 50 ml，谷氨酰胺 10 ml，慶大霉素5 ml。將上述溶液分成10份，每份100 ml，取9份，分別滴加不同體積的7.5%NaHCO3調(diào)節(jié) pH 值，使培養(yǎng)液的 pH 值分別為 6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6。

1.2.2 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 將配制好的不同pH值細(xì)胞培養(yǎng)液各10 ml，加到T25培養(yǎng)瓶中。從液氮中取出凍存的細(xì)胞，迅速在37.0℃水浴箱中融化，取適量，分別加入裝有不同pH值培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，輕微搖勻，放置在37.0℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天更換細(xì)胞培養(yǎng)液，以去除細(xì)胞凍存液里的二甲基亞砜(DMSO)，之后繼續(xù)放37.0℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 觀察細(xì)胞形態(tài)變化 每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，包括細(xì)胞的形態(tài)、密度、增殖速度等，并拍照記錄，直至細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層為止。

1.2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù) 在同一生化培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)96 h后，取出培養(yǎng)瓶，倒掉培養(yǎng)液，加入適量的0.25%胰酶消化液，消化半分鐘后倒掉胰酶消化液，作用約5 min直至細(xì)胞松散脫落，加入10 ml培養(yǎng)液吹打細(xì)胞至分散，制成細(xì)胞懸液。顯微鏡下觀察不同pH值培養(yǎng)液中的細(xì)胞形態(tài)，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

細(xì)胞計(jì)數(shù)公式:1 ml細(xì)胞數(shù)=n個(gè)方格細(xì)胞數(shù)之和×稀釋倍數(shù)×10 000/n，計(jì)算出不同pH值培養(yǎng)液中每毫升的細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 不同pH值培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

取出培養(yǎng)的細(xì)胞并置于倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察，可見當(dāng)培養(yǎng)液的pH值＜7.0時(shí)，MRC-5生長(zhǎng)分裂速度緩慢，顯微鏡下細(xì)胞為圓球形，懸浮在培養(yǎng)液中(圖1A);當(dāng)培養(yǎng)液的pH值在7.0－7.1之間時(shí)，細(xì)胞形態(tài)與培養(yǎng)液pH值為7.2－7.3所培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)相仿，唯一的區(qū)別是細(xì)胞分裂生長(zhǎng)速度稍慢(圖1B);當(dāng)培養(yǎng)液的pH值在7.2－7.3之間時(shí)，MRC-5細(xì)胞分裂較快，增殖速度迅速，細(xì)胞形態(tài)良好，細(xì)胞均勻，呈典型的單一梭形外觀，形成細(xì)胞群落(圖1C);當(dāng)培養(yǎng)液的pH值＞7.4時(shí)，MRC-5細(xì)胞逐漸停止分裂生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)肥大、邊緣不規(guī)則，且有部分細(xì)胞破碎(圖1D)。

圖1 不同pH值對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的影響Figure 1 Effect of pH on the morphology of MRC-5 cells

2.2 不同pH值培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞數(shù)量的影響

培養(yǎng)96 h后，分別對(duì)在pH值為6.8－7.6的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果見表1。表1數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)培養(yǎng)液的pH值＜7.0時(shí)，MRC-5細(xì)胞數(shù)目較低;當(dāng)培養(yǎng)液的 pH值在7.0－7.1之間時(shí)，細(xì)胞數(shù)目相對(duì)增加;當(dāng)培養(yǎng)液的pH值在7.2－7.3之間時(shí)，MRC-5細(xì)胞數(shù)目明顯增多，且最高可達(dá)2.37×106/ml;當(dāng)培養(yǎng)液的 pH 值 ＞7.4 時(shí)，MRC-5細(xì)胞數(shù)目明顯降低，可見部分細(xì)胞破碎。

3 討論

細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)于基因工程藥物和疫苗的實(shí)驗(yàn)室研究和工業(yè)化生產(chǎn)非常重要，而細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境對(duì)細(xì)胞的影響極大。細(xì)胞在體外培養(yǎng)，人們可以有計(jì)劃、有選擇、有目標(biāo)地控制細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境，從而可以研究某些特殊條件下的細(xì)胞生物學(xué)行為。確立細(xì)胞培養(yǎng)條件，需要在培養(yǎng)溫度、血清濃度、培養(yǎng)液成分、培養(yǎng)液pH值及培養(yǎng)液滲透壓等方面進(jìn)行反復(fù)實(shí)驗(yàn)。其中pH值對(duì)細(xì)胞行為的影響最大，也最為關(guān)鍵，對(duì)細(xì)胞工業(yè)化生產(chǎn)起著至關(guān)重要的作用［1］。

表1 pH對(duì)細(xì)胞數(shù)量的影響 (n=3)Table 1 Effect of pH on cell number of MRC-5 (n=3)

人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞(MRC-5)作為國(guó)際認(rèn)可的人二倍體細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)株，因用其生產(chǎn)出的生物制品無(wú)外源因子、無(wú)外源性細(xì)胞殘余DNA和無(wú)致瘤性。李亞?wèn)|等報(bào)道，在顯微鏡下觀察，MRC-5細(xì)胞呈單一梭形，細(xì)胞均勻［5］。本文用不同pH值的培養(yǎng)液培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞，經(jīng)顯微鏡觀察，分別從細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)兩個(gè)方面進(jìn)行了分析研究，旨在確定MRC-5細(xì)胞生長(zhǎng)的最佳pH值范圍。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)液的 pH值 ＜7.0時(shí)，MRC-5細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形態(tài)也不規(guī)則;當(dāng)培養(yǎng)液的pH值在7.0－7.1之間時(shí)，細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)速度有所提高，形態(tài)也變得規(guī)則;當(dāng)培養(yǎng)液的pH值范圍為7.2－7.3時(shí)，最適合 MRC-5生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，狀態(tài)良好，且增殖速度最快;當(dāng)培養(yǎng)液的pH值＞7.4時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度變得很慢，甚至停止分裂生長(zhǎng)，部分細(xì)胞破碎、變形。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)還可以看出，MRC-5細(xì)胞對(duì)pH值＞7.4的堿性培養(yǎng)液較敏感，細(xì)胞變形嚴(yán)重;而對(duì)pH值＜7.2的酸性培養(yǎng)液，細(xì)胞則其有一定的耐受，故配制細(xì)胞培養(yǎng)液時(shí)寧可稍偏酸也勿稍偏堿。如果實(shí)驗(yàn)條件允許的話，最好在使用前先測(cè)定其pH值，以確保培養(yǎng)液的pH值是在細(xì)胞生長(zhǎng)的最適范圍內(nèi)。同時(shí)，還應(yīng)每天注意觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的情況及細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液的顏色變化，以便及時(shí)換液或添加NaHCO3。對(duì)于條件較好的實(shí)驗(yàn)室，可以直接將細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口微旋，放入CO2孵箱中培養(yǎng)，在飽和濕度、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)條件下培養(yǎng)［6，7］，這樣可以使細(xì)胞在整個(gè)生長(zhǎng)周期中的pH值保持恒定，避免在細(xì)胞生長(zhǎng)后期因數(shù)量多、代謝快而引起細(xì)胞培養(yǎng)液的pH值下降，最終導(dǎo)致細(xì)胞的脫落和死亡。

細(xì)胞培養(yǎng)最適生長(zhǎng)條件是實(shí)驗(yàn)成功、企業(yè)規(guī)?；a(chǎn)的前提，本文對(duì)MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)液的最適pH值范圍進(jìn)行了科學(xué)性和重復(fù)性研究，為MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)后續(xù)階段的研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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