蓋雪飛，谷 雪，丁朝霞，胡 明，王 斌，陳愛(ài)平，錢(qián)冬萌

(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東青島266003;2青島大學(xué))

卵巢癌是目前病死率最高的婦科惡性腫瘤，居女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之首，嚴(yán)重威脅女性的健康和生命［1］。人轉(zhuǎn)錄激活因子5(ATF5)是轉(zhuǎn)錄激活因子/cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白家族的新成員，不僅參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、應(yīng)激、凋亡等，還參與腫瘤的發(fā)生［2～4］。RNA 干擾(RNAi)技術(shù)可以特異、高效、快速地抑制靶基因的表達(dá)，從而廣泛用于基因治療的研究［5］。2012年11月 ～2013年9月，我們利用ATF5-siRNA慢病毒載體，觀察ATF5基因沉默對(duì)荷人卵巢癌裸鼠移植瘤增殖的影響，以期為卵巢癌的基因治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購(gòu)于上海細(xì)胞庫(kù);SPF級(jí)BALB/C-nude雌性裸鼠30只購(gòu)于北京維通利華，4～6周齡，體質(zhì)量為15～18 g。ATF5-siRNA慢病毒載體購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因公司，小鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)于武漢博士德生物有限公司，TUNEL試劑盒購(gòu)于Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人卵巢癌SKOV3細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，1 000 r/min離心10 mim。無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為5×107/mL，每只裸鼠皮下注射100μL。注射7 d后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組各10只。實(shí)驗(yàn)組瘤內(nèi)注射ATF5-siRNA慢病毒100 μL/(只·次)，陰性對(duì)照組瘤內(nèi)注射空載慢病毒100μL/(只·次)，空白對(duì)照組瘤內(nèi)注射PBS 100 μL/(只·次)，隔天1次，共7次。

1.2.2 成瘤情況觀察 觀察裸鼠的一般情況，包括飲食、睡眠、活動(dòng)狀態(tài)等。每隔3 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量裸鼠皮下移植瘤的最長(zhǎng)徑及最短徑，計(jì)算移植瘤的體積，并繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線。移植瘤體積(V)=0.523 6×長(zhǎng)徑×短徑2。4周后處死裸鼠，取出移植瘤組織并稱(chēng)重，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組抑瘤率。實(shí)驗(yàn)組抑瘤率=(空白對(duì)照組瘤重－實(shí)驗(yàn)組瘤重)/空白對(duì)照組瘤重×100%。

1.2.3 移植瘤組織 ATF5 mRNA檢測(cè) 采用 RTPCR法。Trizol法提取總RNA，RNase處理后逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。ATF5上游引物:5'-AAGTCGGCGGCTCTGAGGTA-3'，下 游 引 物:5'-GGACTCTGCCCGTTCCTTCA-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度:114 bp。內(nèi)參基因βactin上游引物:5'-TGGAACGGTGAAGGTGACAG-3'，下游引物:5'-GGCTTTTAGGATGGCAAGGG-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度:154 bp。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共 30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照，Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析，計(jì)算ATF5 mRNA與內(nèi)參基因的比值。

1.2.4 移植瘤組織ATF5蛋白檢測(cè) 采用Western blot法。提取3組移植瘤組織總蛋白，進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶封閉，加入5%脫脂奶稀釋的兔抗人ATF5多克隆抗體，室溫孵育2 h，4℃過(guò)夜，TBST洗膜。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，TBST洗膜。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光壓片顯色，以β-actin為參照蛋白，用Quantity One軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 移植瘤組織凋亡檢測(cè) 采用TUNEL法。將移植瘤組織制成石蠟切片，脫蠟、水合，細(xì)胞通透液處理組織8 min，加入TUNEL反應(yīng)混合液50μL、convert-POD 50μL，最后加入 DAB底物50μL顯色，中性樹(shù)膠封片。400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù);凋亡細(xì)胞核為棕黃色或棕褐色，其余為藍(lán)色。凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組成瘤情況比較 與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組移植瘤生長(zhǎng)速度明顯減慢，見(jiàn)插頁(yè)Ⅲ圖6。實(shí)驗(yàn)組瘤重(0.63±0.06)g，明顯低于陰性對(duì)照組(1.14 ±0.07)g及空白對(duì)照組(1.25 ±0.08)g，P均＜0.01;陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，P＞0.05。實(shí)驗(yàn)組抑瘤率49.60%。

圖6 3組移植瘤生長(zhǎng)曲線

2.2 3組ATF5 mRNA及蛋白表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)組ATF5 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)分別為0.40±0.09、0.46 ±0.05，陰性對(duì)照組分別為 0.67 ±0.07、0.72±0.03，空白對(duì)照組分別為 0.80 ± 0.07、0.82 ±0.05;實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組比較，P均＜0.01;空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，P ＞0.05。見(jiàn)圖 1、2。

2.3 3組移植瘤組織AI比較 實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組移植瘤組織AI分別為34.63% ±1.91%、6.04% ±0.19%、5.07% ±0.20%，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組比較，P均＜0.01;陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，P＞0.05。

3 討論

圖1 3組ATF5 m RNA表達(dá)

圖2 3組ATF5蛋白表達(dá)

卵巢癌的病死率位居?jì)D科惡性腫瘤首位，盡管手術(shù)技巧的提高及順鉑、紫杉醇等化療藥物的臨床應(yīng)用為卵巢癌患者帶來(lái)多重生機(jī)，但其5年生存率仍然停滯不前，主要原因是70%以上的卵巢癌診斷時(shí)病變已超出卵巢，屬于晚期并對(duì)化療耐藥。隨著分子生物學(xué)及基因?qū)W等基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，與卵巢癌有關(guān)的新基因不斷被發(fā)現(xiàn)，對(duì)這些基因的研究為卵巢癌的診斷和靶向治療提供了許多新靶點(diǎn)［6，7］。ATF5在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等，而在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)［8］。RNAi是一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默［9］。

Angelastro等［10］通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo) ATF5靶向的siRNA轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞，引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生顯著凋亡，而不引起正常腦細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組移植瘤體積及重量均明顯減少，其抑瘤率達(dá)49.60%。該結(jié)果表明，慢病毒介導(dǎo)的ATF5-siRNA可以直接感染移植瘤組織并抑制其增殖。本研究中，與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組移植瘤組織內(nèi)ATF5 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)均明顯減低，說(shuō)明慢病毒介導(dǎo)的ATF5-siRNA能抑制荷人卵巢癌裸鼠移植瘤中ATF5基因的表達(dá);而實(shí)驗(yàn)組AI則明顯升高，結(jié)合3組腫瘤生長(zhǎng)曲線可知，ATF5能明顯抑制荷人卵巢癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡。以上結(jié)果均與齊亞妮等［11］的研究結(jié)果一致。

綜上所述，ATF5-siRNA慢病毒直接注射后可以成功感染移植瘤，導(dǎo)致ATF5 mRNA及蛋白表達(dá)的下降，從而抑制荷人卵巢癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，并能誘導(dǎo)移植瘤組織內(nèi)細(xì)胞的凋亡。因此，ATF5可能是卵巢癌基因治療的有效靶點(diǎn)。這為ATF5作為靶基因，應(yīng)用于卵巢癌的臨床治療提供理論依據(jù)。

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