余錄，胡光強(qiáng)，李永杰，陳碧瓊(瀘州醫(yī)學(xué)院:化學(xué)教研室；解剖教研室；藥物與功能性食品研究中心，四川瀘州646000）

山奈酚對(duì)慢性腦缺血大鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞和軸突的影響

余錄，胡光強(qiáng)1，李永杰2，陳碧瓊
(瀘州醫(yī)學(xué)院:化學(xué)教研室；1解剖教研室；2藥物與功能性食品研究中心，四川瀘州646000）

目的:觀察山奈酚對(duì)慢性腦缺血大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glialfibrillary acidic Protein，GFAP）和β淀粉樣前體蛋白（βam yloid PrecursorProtein，β-APP）的影響，探討其對(duì)星型膠質(zhì)細(xì)胞和軸突的作用。方法:將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、山奈酚治療組，采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎建立大鼠慢性腦缺血模型，用免疫組織化學(xué)法檢測大鼠腦組織GFAP和β-APP的表達(dá)。結(jié)果:與假手術(shù)組比較，模型組GFAP和β-APP陽性表達(dá)顯著增加（P＜0.01)，而山奈酚治療組顯著減少GFAP和β-APP的過度表達(dá)，較之于模型組有明顯的改善（P＜0.05）。結(jié)論:山奈酚對(duì)慢性腦缺血損傷大鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞和軸突具有保護(hù)作用。

山奈酚;慢性腦缺血;星型膠質(zhì)細(xì)胞;軸突

慢性腦缺血是指各種原因引發(fā)的長期腦血流灌注不足，在阿爾茨海默病（Alzheimer'sdisease，AD）、血管性癡呆（vascular dementia,VD）等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中，神經(jīng)元的保護(hù)一直是主軸。但是，隨著近年來的研究發(fā)展，膠質(zhì)細(xì)胞、軸突等營養(yǎng)、支持結(jié)構(gòu)的保護(hù)受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，即提倡既要保護(hù)腦灰質(zhì)，也要保護(hù)腦白質(zhì)的全腦保護(hù)概念[1]。山奈酚（Kaempferol）屬于黃酮醇類，是一種植物雌激素，主要來源于姜科植物山奈的根莖，也廣泛存在于多種水果、蔬菜中，具有抗癌、降糖等多種藥理學(xué)效應(yīng)[2-3]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦缺血的研究中也顯示其有效性，但目前尚無其在缺血后腦白質(zhì)部分作用的研究。本研究通過雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎（bilateralcommon carotid artery occlusion，BCCAO）建立大鼠慢性腦缺血損傷模型，探討山奈酚對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞和軸突的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

山奈酚由成都曼斯特生物科技有限公司提供（純度大于或等于98%，淡黃色粉末，批號(hào)：MUST-12102503），GFAP、β-APP多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），生物素化羊抗兔IgG、SABC試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性Wistar大鼠，體重180～220g，購自重慶滕鑫生物技術(shù)有限公司，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組，模型組和山奈酚治療組（15mg/kg，ip）。山奈酚溶解于二甲基亞砜（DMSO），假手術(shù)組和模型組給予等體積的溶媒，均于術(shù)后2 h至3周每日定時(shí)給予。死亡大鼠剔除，并進(jìn)行相應(yīng)補(bǔ)充。

1.3 BCCAO模型的建立

參照de la Torre等[4]的方法制作大鼠慢性腦缺血模型。用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射（ip）將大鼠麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，從頸部正中切口，依次結(jié)扎左右兩側(cè)頸總動(dòng)脈，假手術(shù)組只分離動(dòng)脈不結(jié)扎，術(shù)中用紅外線燈照射保持大鼠體溫在37℃。1.4組織切片的制備

每組5只大鼠，術(shù)后21 d用冰凍的PBS溶液及4%的多聚甲醛溶液灌流取腦，用10%中性甲醛固定48h，從大腦前囟-0.26mm處向后切取厚約3mm的冠狀腦組織，石蠟包埋，制作腦部冠狀切片，厚度約5μm，用于免疫組織化學(xué)染色。

1.5 GFAP和β-APP免疫組化檢測

免疫組織化學(xué)染色采用SABC法。將石蠟切片在55℃烤3 h，二甲苯脫蠟、梯度乙醇中復(fù)水，3%的H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，然后用微波在98℃進(jìn)行抗原修復(fù)10min，再用5%BSA封閉，加稀釋的一抗（GFAP和β-APP）于37℃孵育2 h，繼而移置于4℃冰箱過夜。次日加二抗孵育1 h、清洗，滴加SABC，37℃孵育1h后，清洗。然后用DAB顯色、蘇木素進(jìn)行復(fù)染以及鹽酸酒精進(jìn)行分化、再用自來水返藍(lán)、脫水封片。

1.6 圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

免疫組化染色后，在400倍光學(xué)顯微鏡下，每張切片取同側(cè)額葉皮層區(qū)計(jì)算每0.25mm2區(qū)域額葉皮層區(qū)GFAP陽性表達(dá)數(shù)。β-APP陽性軸突在每張胼胝體固定位置選取3個(gè)不重疊的區(qū)域采圖，采集圖片用ImagePro-plus5.0軟件分析計(jì)算免疫反應(yīng)陽性的累積光密度值(IOD)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析的方法進(jìn)行，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 山奈酚對(duì)BCCAO大鼠胼胝體β-APP表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組基本無β-APP軸突染色，模型組的β-APP陽性表達(dá)主要聚集于腦白質(zhì)區(qū)域的胼胝體和內(nèi)囊，少量出現(xiàn)在皮層。而山奈酚治療組減少胼胝體β-APP的聚集（圖1A1～C1）。通過統(tǒng)計(jì)分析，治療組與模型組的IOD比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 山奈酚對(duì)BCCAO大鼠GFAP、β-APP表達(dá)的影響（s,n=5）

表1 山奈酚對(duì)BCCAO大鼠GFAP、β-APP表達(dá)的影響（s,n=5）

注：與模型組比較，a P＜0.05；b P＜0.01

組別假手術(shù)組模型組山奈酚治療組（15mg/kg）GFAP陽性細(xì)胞數(shù)/0.25mm215.00±2.38b88.25±13.46 36.48±10.51aβ-APP(IOD）2772.42±546.48b10598.53±2369.23 5492.19±1590.51a

2.2 山奈酚對(duì)BCCAO大鼠額葉皮層GFAP表達(dá)的影響

免疫組化染色顯示，GFAP陽性細(xì)胞呈棕黃色。假手術(shù)組有少量正常的GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)，胞體較小、分支較細(xì)。而模型組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量增多，且體積增大，突起多而粗；與模型組相比，山奈酚處理明顯減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減輕膠質(zhì)瘢痕的形成（圖1A2～C2）。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示：與模型組比較,山奈酚顯著降低GFAP陽性細(xì)胞的表達(dá)，在細(xì)胞數(shù)量上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

3 討論

慢性腦缺血的組織病理學(xué)改變主要表現(xiàn)為膠質(zhì)細(xì)胞的增生活化、軸突變性、脫髓鞘等。星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦中分布最多、體積最大的一類細(xì)胞，占神經(jīng)細(xì)胞的50%～60%，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)扮演重要角色，它具有支持、營養(yǎng)和穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境的作用,其終足與神經(jīng)元、血管之間形成雙向通信。在慢性腦缺血的進(jìn)程中，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生形成膠質(zhì)瘢痕，進(jìn)一步加重腦缺血白質(zhì)的病理損傷[5]。同時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞為軸突提供能量支持并影響突觸的生理活動(dòng)[6]，而軸突是實(shí)現(xiàn)中樞信號(hào)傳遞的主要渠道，它將細(xì)胞體發(fā)出的神經(jīng)沖動(dòng)傳遞給其它神經(jīng)元或分布在肌肉或腺體的效應(yīng)器。多項(xiàng)研究表明，軸突損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)警器[7]，因此，本實(shí)驗(yàn)研究選取星形膠質(zhì)細(xì)胞和軸突作為治療靶點(diǎn)。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞特有的一種細(xì)胞骨架蛋白，是成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性的分子標(biāo)志[8]。β-APP是β淀粉樣蛋白(amyloidβ peptide,Aβ）的前體物質(zhì)，在正常情況下，β-APP處于較低水平，但在缺血損傷、阿爾茨海默病時(shí)表達(dá)增高或由于軸突運(yùn)輸中斷而出現(xiàn)聚集[9]。因此，GFAP和β-APP的表達(dá)成為衡量星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和軸突損傷的敏感指標(biāo)。

已有研究表明，山奈酚能顯著降低脂多糖（lipopolusaccharide，LPS）誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，暗示其在神經(jīng)炎癥疾病的治療具有潛在的可能性[10]。另外，山奈酚還能保護(hù)3-硝基丙酸引起的腦紋狀體降解[11]。在腦缺血再灌注損傷中，山奈酚也顯示其腦保護(hù)作用[12-13]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎建立大鼠慢性腦缺血損傷模型并給予山奈酚處理，結(jié)果顯示，山奈酚降低GFAP在慢性低灌注大鼠腦額葉的陽性表達(dá)，并抑制β-APP的表達(dá)，減少其在胼胝體的聚集，表明山奈酚對(duì)慢性腦缺血星形膠質(zhì)細(xì)胞和軸突有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

圖1 GFAP和β-APP免疫組化（×400）

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（2013-10-24收稿）

Effectsofkaem p ferolon astrocytesand axonsof ratsw ith chronic cerebralischem ia

Yu Lu,HuGuangqiang1,LiYongjie2,Chen Biqiong
DepartmentofChemistry；1DepartmentofAnatomy；2DrugDiscoveryResearch Center,LuzhouMedicalCollege

Objective：Toexplore the effects of Kaempferolon astrocytesand axonsof ratswith chronic cerebral ischemia bymeasuring the expression of glial fibrillary acidic protein(GFAP)andβ-amyloid preeursor protein(β-APP).Methods：The ratswere random ly divided into sham operation group,model group and Kaempferol treated group.Chronic cerebral ischemiamodelwas performed by bilateral common carotid artery ligation(BCCAO)，and the expression of GFAP andβ-APPwere observated by immunohistochemicalmethod.Resu lts:Compared with sham operation group,the expression of GFAP andβ-APP increased significantly in model group(P＜0.01),while the expression ofGFAPandβ-APP in Kaempferol treated group was less than inmodelgroup(P＜0.05).Conclusion: Kaempferolcan protectastrocytesand axonsof ratswith chronic cerebralischemia.

Kaempferol;Chronic cerebralischemia;Astrocytes;Axons

R741.05

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2014.02.015

余錄（1974-），女，實(shí)驗(yàn)師，E-mail:yulu863@sina.com