張永虎，于海峰，侯建華，李素萍，呂品，于志賢

1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，呼和浩特 010018；

2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010031

利用向日葵重組自交系構(gòu)建遺傳圖譜

張永虎1，于海峰2，侯建華1，李素萍2，呂品1，于志賢1

1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，呼和浩特 010018；

2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010031

以向日葵自選系K55為母本、K58為父本雜交組合，通過單粒傳得到的187個F5：6代重組自交系群體為作圖材料，聯(lián)合應(yīng)用SSR和AFLP標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。經(jīng)過78對SSR引物和48對AFLP引物組合選擇性擴(kuò)增，分別得到341和1119條帶，共1460條，分別獲得多態(tài)性條帶184條和393條，共577條多態(tài)性條帶，占所有條帶的39.52%。SSR和AFLP標(biāo)記各有84個和108個多態(tài)性標(biāo)記偏離孟德爾分離比例(P=0.05)，共192個偏分離標(biāo)記。采用JoinMap4.0軟件進(jìn)行連鎖分析，構(gòu)建了1張總長度為2759.4 cM、包含17個連鎖群、連鎖495個多態(tài)性標(biāo)記的遺傳圖譜，其中偏分離標(biāo)記 170個，標(biāo)記間的平均圖距為 5.57 cM。每個連鎖群上分布有 5～72個標(biāo)記，長68.88～250.17 cM。本圖譜為向日葵永久性圖譜，為向日葵重要性狀QTL定位和基因克隆奠定基礎(chǔ)。

向日葵；重組自交系；SSR；AFLP；分子連鎖圖譜

遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建是遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究的重要方面，是復(fù)雜性狀基因組結(jié)構(gòu)和功能的比較分析、QTLs定位、圖位克隆等研究的重要基礎(chǔ)，也是當(dāng)前遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)。伴隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，基于不同原理的多種分子標(biāo)記技術(shù)不斷被開發(fā)出來，常用于遺傳作圖的分子標(biāo)記有 RFLP、RAPD、SSR和AFLP標(biāo)記[1]。在實際研究中RFLP的多態(tài)性程度不高，而且大多數(shù) RFLP標(biāo)記為多個位點(diǎn)；RAPD標(biāo)記步驟簡單，但重復(fù)性差且多態(tài)性低；SSR多態(tài)性高且多數(shù)位點(diǎn)單一穩(wěn)定，常被作為錨定標(biāo)記；AFLP標(biāo)記既有RAPD標(biāo)記方便快捷的特點(diǎn)，又具有RFLP標(biāo)記的穩(wěn)定性和可靠性[2,3]。所以，本研究利用SSR標(biāo)記作為錨定標(biāo)記，用AFLP標(biāo)記填補(bǔ)空隙，構(gòu)建較高密度的分子遺傳圖譜，既有助于圖譜的連鎖群或染色體的歸并又方便不同連鎖群的整合。

向日葵是一種重要的油料作物，其連鎖遺傳圖譜構(gòu)建研究已有近20年的歷史，早期遺傳圖譜多是利用 RFLP構(gòu)建，目前向日葵分子遺傳圖譜的構(gòu)建落后于其他作物。1995年 Genzbittel等[4]構(gòu)建了第 1張含有237個RFLP位點(diǎn)、連鎖群總長度為1150 cM的向日葵遺傳圖譜，并于 1999年利用 7個 F2群體的cDNA對這個圖譜進(jìn)行了補(bǔ)充[5]。1996年P(guān)eerbolte等[6]利用AFLP標(biāo)記構(gòu)建了一個具有523個標(biāo)記位點(diǎn)的向日葵遺傳圖譜。2002年 Tang等[7]利用 SSR標(biāo)記通過RILs群體構(gòu)建了向日葵遺傳連鎖圖譜，該圖譜包含 408個 SSR位點(diǎn)、17條連鎖群，總長度為1368.3 cM，標(biāo)記間距為3.1 cM。2012年黃先群等[8]以重組自交系為材料用35個SSR標(biāo)記加密了Fabre F構(gòu)建的包含323個AFLP標(biāo)記的連鎖圖譜。至今國內(nèi)外已經(jīng)報道了超過10張向日葵分子圖譜，構(gòu)建連鎖圖譜用到的AFLP標(biāo)記均為EcoRⅠ和MseⅠ內(nèi)切酶組合[6,9]。本研究以187個向日葵重組自交系為作圖群體，利用PstⅠ和MseⅠ組合的AFLP標(biāo)記和SSR標(biāo)記構(gòu)建高密度的遺傳連鎖圖譜，旨在豐富向日葵遺傳連鎖圖譜的位點(diǎn)，為今后重要性狀的QTL定位和基因克隆及分子育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 構(gòu)圖群體

以內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院提供的干旱敏感型自選系K55與耐旱型自選系K58配制雜交組合，通過單粒傳得到的187個F5:6代重組自交系為作圖群體。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

向日葵葉片中多酚的含量比較高，基因組的DNA比較難提純。故本實驗參照陳昆松等[10]改良的CTAB法提取DNA并加以改進(jìn)，在氯仿：異戊醇(24:1)抽提兩次后，再用1.5倍1×CTAB 沉淀一次DNA，提高DNA的質(zhì)量。

1.2.2 SSR分析

SSR分析的PCR反應(yīng)條件采用本實驗室報道[11]的體系及擴(kuò)增條件，引物合成按照 NCBI公布的向日葵微衛(wèi)星序列合成。

1.2.3 AFLP分析

AFLP分析技術(shù)參照Vos等[2]的方法，并加以改進(jìn)，用PstⅠ和MseⅠ內(nèi)切酶組合同時加入T4連接酶，37℃酶切連接14 h，把接頭連接到酶切片段上。然后用不含選擇性堿基的引物對酶切連接進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋 30倍作為模板，用 PstⅠ3個選擇性堿基和 MseⅠ2個選擇性堿基的引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%的聚丙烯酰胺變性膠電泳，采用銀染法檢測結(jié)果[12]用氫氧化鈉顯影。

1.3 數(shù)據(jù)整理和連鎖分析

根據(jù)SSR和AFLP標(biāo)記的聚丙烯酰胺檢測顯影結(jié)果，將各株系的帶型按親本類型歸類，與母本帶型一致的賦值為1，與父本帶型一致的賦值為0，由于各種原因帶型不清楚的或數(shù)據(jù)缺失的賦值為 2。圖譜構(gòu)建所采用的軟件是JoinMap 4.0，根據(jù)軟件的要求將獲得的標(biāo)記數(shù)據(jù)“0”、“1”和“2”原始矩陣轉(zhuǎn)換“b”、“a”和“c”的數(shù)據(jù)格式，導(dǎo)入軟件。在Groupings (tree) 窗口下，用Calculate命令進(jìn)行標(biāo)記連鎖分組(LOD=2.0-10.0)，然后選用LOD≥4.0標(biāo)記連鎖組群，用Create Groups use the Groupings tree命令獲得用于作圖的組群，用Calculate map命令建立框架圖，并采用Kosambi函數(shù)[13]進(jìn)行圖譜距離計算。再將能夠連鎖的偏分離標(biāo)記逐個加入框架圖中得到最終圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本間多態(tài)性分析

利用雙親組合從 300對 SSR引物中篩選到 78對，從90對AFLP引物組合中篩選到48對多態(tài)性好、條帶清晰的引物組合。用篩選出的 126對引物組合對 187個 F5:6群體的單株基因組進(jìn)行多態(tài)性分析。由于大部分標(biāo)記在后代中沒有同時出現(xiàn) AA、Aa和 aa 帶型，便于統(tǒng)計所有的標(biāo)記都按照顯性標(biāo)記統(tǒng)計。這些引物共擴(kuò)增出1460個標(biāo)記，其中SSR標(biāo)記341個，AFLP標(biāo)記1119個；具有多態(tài)性的顯性標(biāo)記577個，184個SSR 標(biāo)記，393個AFLP標(biāo)記。經(jīng)卡方(χ2)測驗(P=0.05)，有192個標(biāo)記偏離孟德爾分離比例，占多態(tài)性標(biāo)記的33.28%(表1)，其中SSR 84個，AFLP 108個。

2.2 遺傳圖譜構(gòu)建

利用JoinMap4.0軟件對該群體的577個多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，得到一張含17個連鎖群的遺傳圖譜(表2，圖1)，495個標(biāo)記定位到該圖譜上，SSR標(biāo)記155個，AFLP標(biāo)記340個，29個SSR標(biāo)記和53個 AFLP標(biāo)記沒有進(jìn)入連鎖圖譜，這些標(biāo)記來自母本 K55和父本 K58的比例基本為 1:1。圖譜全長2759.40 cM，標(biāo)記間距0～57.88 cM，平均5.57 cM。17個連鎖群上的標(biāo)記數(shù)在 5～72個之間，其中 1～8連鎖群上分布的標(biāo)記比較多，連鎖群長度在68.88～250.17 cM之間，第1連鎖群上分布的標(biāo)記最多有72個，長250.17 cM，第14連鎖群上分布的標(biāo)記最少只有5個，長度也最短為68.88 cM。

表1 用于組圖的不同類型標(biāo)記

表2 向日葵17個連鎖群的特性

經(jīng)Excel中相關(guān)系數(shù)函數(shù)Pearson計算，本研究中各連鎖群的標(biāo)記數(shù)和連鎖群長度的相關(guān)系數(shù)為0.984，達(dá)到極顯著水平，表明這些標(biāo)記在圖譜上是隨機(jī)分布的。標(biāo)記在連鎖群上的分布并不均勻，只有第3、第4連鎖群上沒有出現(xiàn)大于20 cM的間隙，總共出現(xiàn)了30個大于20 cM的間隙，第14連鎖群上出現(xiàn)了一個超過50 cM的大間隙。在第1、第3、第4、第6和第8連鎖群上出現(xiàn)了以AFLP為主的小范圍標(biāo)記密集區(qū)，這些密集區(qū)分布于整個連鎖群上。SSR和AFLP兩種標(biāo)記在各個連鎖群上的比例不一樣，只有第2、第7、第12和第14連鎖群上的SSR標(biāo)記多于AFLP標(biāo)記，第8、第9、第13、第16和第17連鎖群上只有AFLP標(biāo)記。

圖1 向日葵分子遺傳連鎖圖譜“*”表示偏分離標(biāo)記。

這張遺傳圖譜上共分布有170個偏分離標(biāo)記，每個連鎖群上或多或少都有偏分離標(biāo)記，但大多數(shù)的偏分離標(biāo)記主要分布在少數(shù)幾個連鎖群上，且在連鎖群上呈分散狀分布，但在第2、第3、第4、第6、第8和第12這6個連鎖群上以3～4個偏分離標(biāo)記聚集形成了13個偏分離熱點(diǎn)區(qū)。170個偏分離標(biāo)記中有87個為母本K55的特異位點(diǎn)，83個為父本K58的特異位點(diǎn)，基本符合1:1。

3 討 論

3.1 構(gòu)建高密度的分子連鎖圖譜工作量大、費(fèi)用高

高密度分子連鎖圖譜往往是不同研究者共同的成果，有效避免了資源浪費(fèi)。對不同研究者采用不同群體構(gòu)建的連鎖圖譜進(jìn)行整合，要求有公共的、穩(wěn)定的錨定標(biāo)記。SSR標(biāo)記穩(wěn)定性好，位點(diǎn)的平均多態(tài)信息量最高，AFLP標(biāo)記多態(tài)性檢測效率最高[14]，因而構(gòu)建高密度遺傳圖譜最常用的方法是借助于SSR標(biāo)記錨定連鎖群，利用AFLP標(biāo)記加密圖譜[1]。本研究以 155個 SSR標(biāo)記錨定連鎖群，與 Tang

等[7]2002年構(gòu)建，并在2003年[15]加密的向日葵SSR分子連鎖圖譜有很好的吻合性，有78個標(biāo)記與之相關(guān)聯(lián)。本研究構(gòu)建的向日葵分子遺傳圖譜有17個連鎖群，總長2759.4 cM，共計495個標(biāo)記，有340個PstⅠ/MseⅠ組合的AFLP標(biāo)記，155個SSR標(biāo)記，標(biāo)記間平均距離為5.57 cM，是國內(nèi)最為致密的圖譜，達(dá)到了QTL定位的要求[16]。目前向日葵遺傳圖譜構(gòu)建的缺憾是還沒有將向日葵的連鎖群與對應(yīng)的染色體聯(lián)系起來。相信隨著向日葵全基因組測序工作的開展，這17個連鎖群與向日葵17條染色體的關(guān)系很快就能明確[17]。

3.2 AFLP內(nèi)切酶選擇

AFLP標(biāo)記檢測多態(tài)性的效率不僅與供試材料的基因型有關(guān)，與所使用的限制性內(nèi)切酶組合亦相關(guān)。Powell等[18]在小麥研究中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)群體使用PstⅠ/MseⅠ比 EcoRⅠ/MseⅠ組合多態(tài)性檢測效率高，他們認(rèn)為主要原因在于PstⅠ對堿基甲基化不敏感，所以由甲基化引起 DNA的多態(tài)性變化 PstⅠ/MseⅠ也能夠檢測到。本研究AFLP標(biāo)記使用PstⅠ/MseⅠ組合多態(tài)性為 35.1%，而劉杰等[19]使用的EcoRⅠ/MseⅠ組合多態(tài)性是 12.8%，說明向日葵AFLP標(biāo)記研究中PstⅠ/MseⅠ比EcoRⅠ/MseⅠ的多態(tài)性檢測率高。大量的研究表明，PstⅠ/MseⅠ組合的背景噪音比較低，擴(kuò)增出來的條帶較少，但是多態(tài)性條帶比例比較高，容易識別，標(biāo)記在連鎖群上的分布比較均勻，更適合遺傳多樣性的分析和遺傳連鎖圖的構(gòu)建。本研究中在第1、第3、第4、第6和第8連鎖群上出現(xiàn)了以AFLP為主的小范圍標(biāo)記密集區(qū)，這些密集區(qū)分布于整個連鎖群上，不同于大豆[1]、白菜[20]使用 AFLP構(gòu)建分子連鎖圖譜，聚集區(qū)分布于著絲粒兩端，這可能是大多數(shù)分子連鎖圖譜構(gòu)建中用到的AFLP標(biāo)記都是使用EcoRⅠ/MseⅠ雙酶切組合，EcoRⅠ對著絲粒附近富含的甲基化胞嘧啶比較敏感，容易在這一區(qū)域發(fā)生標(biāo)記聚集現(xiàn)象[1,20]。

3.3 偏分離現(xiàn)象

遺傳偏分離是自然界中一種普遍存在的現(xiàn)象[21]，是生物進(jìn)化強(qiáng)有力的動力，也是降低遺傳作圖精度的因素之一，幾乎所有的作圖群體都會存在，在遠(yuǎn)緣雜交組合的分離群體及DH和RIL群體中尤為普遍。Knox等[22]認(rèn)為造成標(biāo)記發(fā)生偏分離的原因有很多，諸如配子體和孢子體發(fā)育階段基因型的選擇、遺傳搭車效應(yīng)、染色體片段的丟失、非同源染色體重組和環(huán)境因素等，作圖群體的親本不純合也會引發(fā)偏分離。另外，不同類型的分子標(biāo)記發(fā)生偏分離的幾率不同，一般情況下顯性標(biāo)記比共顯性標(biāo)記發(fā)生偏分離的比例要高[23]。偏分離標(biāo)記可能會影響連鎖的檢驗，但偏分離標(biāo)記和正常分離標(biāo)記有相同的作圖效率，不能直接的把偏分離標(biāo)記刪除，如果將偏分離標(biāo)記全部篩掉排除，會影響圖譜對基因組的覆蓋率，還有可能丟掉一些QTL位點(diǎn)[24]。本研究構(gòu)建出的連鎖圖譜包含了495個標(biāo)記，有170個偏離標(biāo)記，占標(biāo)記位點(diǎn)的34.34%，本研究所使用的材料為向日葵重組自交系，向日葵屬于異花作物，有一定的自交不親和性，在單粒傳的過程中存在株系缺失，這可能是產(chǎn)生較高偏分離的原因之一。

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(責(zé)任編委: 陳德富)

Construction of a genetic map of sunflower using a population of recombinant inbred lines (RILs)

Yonghu Zhang1, Haifeng Yu2, Jianhua Hou1, Suping Li2, Pin Lv1, Zhixian Yu1

1. Agricultural College, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China;
2. Inner Mongolia Academy of Agricultural & Animal Husbandry Sciences, Huhhot 010031, China

A genetic linkage map of sunflower was constructed by combined applying the SSR and AFLP markers using 187 F5:6individuals of recombinant inbred lines (RILs) which derived from the cross between Helianthus annuus K55 and Helianthus annuus K58 through single-seed descent (SSD). Using 78 pairs of SSR primers and 48 pairs of AFLP primer, 341 and 1119 bands were amplified, respectively. Among these 1460 bands, 557 bands (39.52%) were polymorphic, including 184 bands by SSR markers and 393 bands by AFLP markers. In the group of these polymorphic bands, 84 bands from SSR markers and 108 bands from AFLP markers showed the genetic distortion (P = 0.05). A total of 192 segregation distortion markers were obtained in this study. By using the JoinMap 4.0 software to do the linkage analysis, a genetic linkage map was established with length of 2759.4 cM, consisted of 17 linkage groups, and comprised of 495 polymorphic molecular markers including 170 segregation distortion markers. The mean mark-er interval distance is 5.57 cM between markers. In addition, the number of markers in the linkage groups varied from 5 to 72, and the length of linkage groups were from 68.88 cM to 250.17 cM. The genetic map developed in the present study could be used for QTL mapping and gene cloning of sunflower important genes.

sunflower; recombinant inbred lines population; SSR; AFLP; molecular markers linkage map

2014-05-23;

2014-08-18

國家自然科學(xué)基金項目(編號：31160288)和內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金重點(diǎn)項目(編號：2010Zd06)資助作者簡介: 張永虎，博士研究生，研究方向：作物抗性遺傳改良。E-mail: zhangyonghu0815@126.com

侯建華，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向：作物抗逆性狀的遺傳改良。E-mail: Houjh68@163.com

10.3724/SP.J.1005.2014.1036

時間: 2014-9-10 10:28:31

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140910.1028.001.html