劉霞, 張斌, 毛新國, 李昂, 孫美榮, 景蕊蓮

1. 山西大學生物工程學院, 太原 030006;

2. 中國農業(yè)科學院作物科學研究所, 農作物基因資源與基因改良國家重大科學工程, 北京 100081

小麥tae-MIR156前體基因的克隆及其靶基因TaSPL17多態(tài)性分析

劉霞1,2, 張斌2, 毛新國2, 李昂2, 孫美榮1, 景蕊蓮2

1. 山西大學生物工程學院, 太原 030006;

2. 中國農業(yè)科學院作物科學研究所, 農作物基因資源與基因改良國家重大科學工程, 北京 100081

Squamosa-promoter binding protein (SBP)-box基因是植物特有的一類轉錄因子, 廣泛參與植物生長發(fā)育,其部分成員受miR156調控。文章克隆了小麥(Triticum aestivum) tae-MIR156前體基因, 轉錄后能夠形成莖環(huán)結構。小麥10個SBP-box基因中, 僅TaSPL3和TaSPL17在編碼區(qū)存在tae-miR156識別位點。SPL17在普通小麥的 A基因組供體種烏拉爾圖小麥(Triticum urartu, AA) UR209和 B基因組供體種擬斯卑爾脫山羊草(Aegilops speltoides, BB) Y2001中均為多拷貝(SPL17-A1、SPL17-A2和SPL17-A3; SPL17-B1、SPL17-B2和SPL17-B3), 在D基因組供體種粗山羊草(Aegilops tauschii, DD) Ae38中僅檢測到一種序列(SPL17-D); SPL17-A2與SPL17-B2, SPL17-A3與SPL17-B3、SPL17-D兩兩之間序列的一致性程度均大于99%, 且與普通小麥(中國春、衡觀35和雙豐收)的 TaSPL17序列具有較高的一致性, 提示它們可能來源于共同的祖先基因, 并且在進化過程中高度保守。靶基因 TaSPL17中的 tae-miR156識別位點非常保守, 在根據單株穗數和基因型多樣性挑選的 SubP1和SubP2群體中均未檢測到tae-miR156識別位點存在變異堿基。

miR156; SBP-box基因; 多態(tài)性分析; 普通小麥

轉錄因子可以通過 DNA結合域(DNA-binding domains)激活或者抑制基因的表達, 從而調控植物進行正常的生長、分化和代謝[1]。Squamosa-promoter binding protein (SBP)-box基因(SBP-box)也稱作SPL (SQUAMOSA promoter-binding protein-like)基因,是植物特有的一類轉錄因子, 廣泛參與植物的生長發(fā)育[2], 其部分成員受 miR156的調控。MicroRNA (miRNA)在植物的生長發(fā)育過程中具有重要調節(jié)作用, 包括開花時序、新陳代謝以及對多種脅迫的應激反應等[3]。miR156是植物中一個高度保守的miRNA基因家族, 在苔蘚(Bryophyta)及高等植物中都存在, 其靶向的 SBP-box基因通過調控 miR172,進而調節(jié)植物幼年期和成年期之間的轉變[4]。Wu等[5]揭示了 miR156通過其靶基因 SPL9/SPL10調控miR172的表達。miR156在苗期表達量最高, 隨著植物的生長表達量降低, 其靶向的 SBP-box基因含量則逐漸上升。當靶向 SBP-box基因的表達量達到一定程度時, 則激活下游基因的表達, 從而誘導植物開花[4,5]。

SBP-box基因最早在金魚草(Antirrhinum majus)中發(fā)現(SBP1和SBP2), 能夠結合花器官分生組織決定基因SQUAMOSA的啟動子[6]。根據對基因組序列進行分析, SBP-box基因在萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中有 19～22個成員(CrSPL), 小立碗蘚(Physcomitrella patens)中有14個成員(PpSBP), 江南卷柏(Selaginella moellendorffii)中有 13個成員(SmSBP), 擬南芥(Arabidopsis thaliana)中有17個成員(AtSPL), 水稻(Oryza sativa)中有19個成員(OsSPL),玉米(Zea mays)中有31個成員(ZmSBP)[1,7,8]。最近研究表明, SBP-box基因除了促進植物不同生育相之間的轉變, 在調控花和果實發(fā)育方面也具有重要作用,進而影響產量。在水稻中, OsSPL16控制籽粒大小和形狀, 進而影響稻米的產量和品質。OsSPL16中存在 miR156的識別位點, 對該位點的多態(tài)性分析結果表明：來自伊朗水稻品種Amol3的OsSPL16基因中的miR156識別位點處存在2 bp的插入缺失, 將這種新的等位變異位點導入高產水稻品種HJX74中,可以顯著提高稻米品質, 同時產量保持不變; 將該基因導入水稻品種 Basmati中, 在保證優(yōu)質的基礎上, 可以使產量提高14%左右[9]。OsSPL14能夠調控水稻的株型進而增加產量, 同時 OsSPL14也受miR156的調控。例如在粳稻品系Shaoniejing和Ri22中發(fā)現該識別位點的一個點突變擾亂了 miR156對OsSPL14的調控, 使水稻分蘗減少, 穗粒數和千粒重增加, 同時莖稈變得粗壯, 抗倒伏能力增強, 進而提高產量; 將該變異位點導入粳稻品種秀水11中,可使產量提高約10%[10]。

迄今為止, 關于 tae-miR156與小麥 SPL基因(Triticum aestivum SQUAMOSA promoter-binding protein-like, TaSPL)家族成員的研究報道較少, 兩者的靶向關系還不清楚, 尚未見到靶基因中tae-miR156識別位點(miRNA responsive element, MRE)處的多態(tài)性研究報道。本研究以本實驗室前期克隆的 10個小麥 TaSPL基因為基礎, 克隆了tae-MIR156前體基因(pre-miRNA), 研究其與TaSPL基因的靶向關系, 明確具有tae-miR156識別位點的TaSPL基因。同時對小麥前體tae-MIR156和TaSPL17進行基因序列結構分析, 根據單株穗數和基因型的多態(tài)性, 從300份普通小麥中挑選出兩個小群體(31份和30份材料)檢測tae-miR156識別位點處的多態(tài)性, 以期為深入研究 TaSPL17的功能、揭示tae-miR156與TaSPL17對小麥生長發(fā)育的影響、篩選優(yōu)異等位基因提供依據。

1 材料和方法

1.1 植物材料

實驗材料由中國農業(yè)科學院作物科學研究所提供。普通小麥品種偃展4110用于基因克隆。3份普通小麥(AABBDD, 2n=6x=42)中國春、衡觀35和雙豐收用于檢測基因全長序列多態(tài)性; 3份普通小麥的二倍體野生近緣種：烏拉爾圖小麥 UR209(Triticum urartu, AA, 2n=2x=14)、擬斯卑爾脫山羊草Y2001(Aegilops speltoides, SS, 2n=2x=14)和粗山羊草Ae38(Aegilops tauschii, DD, 2n=2x=14)用于判斷普通小麥中目的基因序列的基因組來源。

一套由 300份普通小麥組成的自然群體于2010～2011年同時種植在中國農業(yè)科學院作物科學研究所昌平和順義兩個實驗基地[11]。在越冬前、拔節(jié)期、開花期和灌漿期各灌溉一次, 每次灌水量為75 mm。每份材料種4行小區(qū), 行長2 m, 行距0.3 m,每行點播40粒種子。開花期以后調查單株穗數, 即有效分蘗。在每個小區(qū)的中間行中間區(qū)段調查 6株的單株穗數, 取平均值。本研究從該群體中挑選兩個小群體, 命名為SubP1和SubP2, 通過測序來檢測靶基因中tae-miR156靶位點的多態(tài)性。SubP1是根據單株穗數調查結果挑選出的31份材料, 其中多穗材料16份, 少穗材料15份。SubP2是根據126個SSR標記位點的多態(tài)性信息挑選出的 30份多態(tài)性高的材料[11]。SubP1和 SubP2材料的基本情況見表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA、RNA的提取及RT-PCR

利用CTAB法提取普通小麥偃展4110葉片中基因組DNA。取偃展4110苗期頂端分生組織、葉片以及拔節(jié)期 2 cm 左右的幼穗, 液氮速凍, 采用TRIZOL法提取總RNA, 用DNase I去除DNA, 利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。以總RNA為模板, 用M-MLV Reverse Transcriptase反轉錄酶(Invitrogen公司)合成cDNA第一鏈。混合上述取樣材料的cDNA, 用于基因克隆。

1.2.2 目的基因的擴增和測序

PCR擴增體系為 15 μL, 其中 TransStart Fast Pfu DNA Polymerase 0.3 U。PCR擴增條件為：96℃5 min; 96℃ 1 min, 52～62℃ 45 s, 72℃ 3 min, 32個循環(huán); 72℃ 10 min; 4℃保存。按照北京百泰克生物技術有限公司 DNA回收試劑盒操作說明回收目標產物。將回收的產物連接到 pEASY-Blunt Simple Cloning Vector, 轉化 Trans1-T1 Phage Resistant E. coli 感受態(tài)細胞(北京全式金生物技術有限公司),挑取陽性克隆, 根據BigDye Terminator Kit(ABI公司)說明進行測序。

1.2.3 小麥tae-MIR156前體基因與TaSPL17的克隆

根 據 tae-MIR156 前 體 序 列 (miRbase: MI0016450), 參照其所在小麥基因組位點的兩側序列(GenBank登錄號：CL902915.1), 分別于前體結構(pre-miRNA)兩端外10 bp左右處設計引物MIRF和MIRR。以普通小麥偃展4110的基因組DNA為模板,進行PCR擴增, 長度約為300 bp。在小麥基因組中擴增TaSPL17所用的引物為TaS17F和TaS17R。中間測序引物為 TaSF2、TaSR2和 TaSR3。檢測靶基因 TaSPL17中 tae-MIR156識別位點所用引物為miR-TaSF和miR-TaSR。本實驗所用引物(表2)均利用 Primer 5.0 設計, 由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.4 基因結構和序列分析

利用Mfold 和 RNAfold軟件預測 tae-MIR156前體基因序列的二級結構[12,13]。通過 psRNATarget進行 tae-miR156靶基因的預測[14], 分析與 10個TaSPL基因[15](TaSPL1、TaSPL3、TaSPL6、TaSPL8、TaSPL15、TaSPL17、TaSPL20-TaSPL23)的靶向關系。利用DNAStar軟件包的SeqMan和MegAlign軟件進行序列拼接、分析和比對。

1.2.5 TaSPL17基因序列相似性分析

根據普通小麥中TaSPL17的序列從GenBank中搜索到水稻(OsSPL14)、擬南芥(AtSPL9)、垂枝樺

(Betula pendula)、江南卷柏、小立碗蘚(SBP13)、萊茵衣藻的SPL基因以及金魚草SBP1和SBP2基因,登錄號依次為GU136674、CAB56591.1、CAD90157.1、XP_002978761.1、ABM67305.1、EDP04027.1、Q38741.1和Q38740.1。將上述搜索到的基因與小麥TaSPL17序列進行相似性分析, 利用SMART軟件分析基因的保守結構域; 用 MEGA 4.1軟件構建系譜進化樹[16,17]。

表1 小麥SubP1和SubP2群體材料名稱及其來源

表2 本文所用的引物信息

2 結果與分析

2.1 小麥 tae-MIR156前體基因序列及轉錄后二級結構預測

以普通小麥偃展 4110的基因組 DNA為模板,擴增 tae-MIR156前體基因(miRbase: MI0016450),對檢測到的24個陽性克隆進行測序, 結果表明小麥偃展4110的tae-MIR156前體基因主要有兩種序列,分別命名為tae-MIR156-1和tae-MIR156-2, 兩種序列的一致性為96.9%。tae-MIR156-1與miRbase數據庫中報道的 tae-MIR156核苷酸序列一致性為97.8%; tae-MIR156-2與 tae-MIR156序列一致性為95.5% (圖 1)。利用 Mfold 和 RNAfold軟件預測tae-MIR156前體基因 3種序列的二級結構, 偃展4110的兩種序列經轉錄后均形成莖環(huán)結構(圖2)。在tae-MIR156 3種序列的二級結構中, 其莖環(huán)結構基本相似, 不過由于三者在中間部位都存在 21 bp的InDel位點, 故 tae-MIR156-1和 tae-MIR156-2比tae-MIR156在中間部位多形成一個由21 bp組成的莖環(huán)狀突起, 其余結構相似, 3種序列中成熟tae-miR156所在臂的位置基本一致(圖2)。

2.2 tae-miR156靶基因預測及TaSPL17基因結構

植物 miRNA與靶基因高度互補, 并引起靶向mRNA的降解, 可以進行靶基因預測[18,19]。在10個小麥 TaSPL家族成員中[15], 僅 TaSPL3和 TaSPL17在編碼區(qū)存在tae-miR156的靶位點(圖3), 表明其受tae-miR156的調控。利用引物TaS17F和TaS17R擴增偃展4110中TaSPL17基因的基因組和cDNA序列,其片段長度分別為4.1 kb和1.2 kb, 該基因結構中包含3個外顯子和2個內含子(圖4：A、B), tae-miR156的靶位點位于第3個外顯子(圖4C)。

2.3 TaSPL17基因同源性分析

將TaSPL17的SBP保守結構域在NCBI中進行BLASTP比對, 在氨基酸水平上發(fā)現與水稻(OsSPL14)、擬南芥(AtSPL9)、SBP_垂枝樺、石松門(SBP_江南卷柏)、苔蘚(SBP13_小立碗蘚)和藻類(SBP_萊茵衣藻)的 SPL基因一致性依次為 82.3%、77.2%、65.8%、76.0%、75.9%和 53.8%; 與最早在金魚草中報道的SBP1和SBP2的一致性為65.8%和67.1% (圖5A)。根據上述SPL基因的SBP保守結構域構建系統(tǒng)進化樹, 結果表明, TaSPL17與OsSPL14親緣關系最近, 與SBP_萊茵衣藻中的SPL基因親緣關系最遠(圖5B)。另外, SBP結構域中包含兩個典型的鋅指結構(Cys3His和Cys2HisCys), 其保守位點見圖5C, 這一結構在綠色植物中普遍存在。

2.4 TaSPL17蛋白質序列多態(tài)性

以小麥偃展4110的cDNA為模板進行PCR擴增和測序, 檢測48個陽性單克隆序列。測序結果表明TaSPL17基因主要分為5種序列, 將其蛋白質序列分別命名為YZ4110_cDNA_1、YZ4110_cDNA_2、YZ4110_cDNA_3、YZ4110_cDNA_4和 YZ4110_ cDNA_5(圖6)。在SBP結構域和tae-miR156的靶位點處(圖6), 5種序列沒有差異, 說明結構域和識別位點具有高度保守性。

2.5 普通小麥及其二倍體野生近緣種 SPL17基因組DNA序列多態(tài)性

圖1 tae-MIR156前體基因3種序列的比對

圖2 tae-MIR156前體基因轉錄后形成的莖環(huán)結構A：miRBase中tae-MIR156前體莖環(huán)結構; B：偃展4110 tae-MIR156-1轉錄后的莖環(huán)結構; C：偃展4110 tae-MIR156-2轉錄后的莖環(huán)結構。圖中黑色方框表示tae-MIR156前體基因序列中成熟tae-miR156的位置。

圖3 tae-miR156靶基因預測

以3份小麥二倍體野生近緣種及3份普通小麥為材料, 用引物 TaS17擴增 SPL17, 每份材料檢測24個單克隆序列。測序結果表明烏拉爾圖小麥(UR209)中有3種序列, 命名為SPL17-A1、SPL17-A2和SPL17-A3; 擬斯卑爾脫山羊草(Y2001)中也有到3種序列, 命名為SPL17-B1、SPL17-B2和SPL17-B3;在粗山羊草(Ae38)中僅擴增到 1種序列, 命名為SPL17-D。因此, SPL17在普通小麥的A基因組供體種烏拉爾圖小麥(UR209)和 B基因組供體種擬斯卑爾脫山羊草(Y2001)中均為多拷貝, 而在D基因組供體種粗山羊草(Ae38)可能為單拷貝。普通小麥 3個野生近緣種中的 SPL17序列具有高度的一致性, 其中 SPL17-A2與 SPL17-B2的序列一致性為 99.2%, SPL17-A3與SPL17-B3、SPL17-A3與SPL17-D的一致性分別為 99.9%和 99.4%, SPL17-B3與 SPL17-D的序列一致性為99.4%(表3)。

圖4 TaSPL17基因cDNA全長及其編碼的氨基酸序列A：TaSPL17基因結構圖; B：小麥偃展4110 基因組DNA中擴增的TaSPL17產物; C：TaSPL17基因SBP結構域與tae-miR156的靶位點。圖C方框中的序列表示TaSPL17基因的SBP結構域; 星號表示TaSPL17基因中的靶位點。

圖5 TaSPL17基因與其他物種SBP-box基因的SBP保守結構域序列A：不同物種SBP-box基因的SBP保守結構域序列一致性分析; B：不同物種SBP-box基因的SBP保守結構域系譜進化分析; C：不同物種SBP-box基因的SBP保守結構域序列多重比對?！硎維BP結構域中兩個鋅指結構的保守位點, 即：Cys、Cys、Cys、His(Cys3His)和Cys、Cys、His、Cys (Cys2HisCys)。

圖6 偃展4110中TaSPL17蛋白質序列比對第一個方框中的序列表示SBP結構域, 第二個方框中的序列表示tae-miR156的靶位點。

表3 小麥二倍體野生近緣種中SPL17基因組DNA序列的一致性分析

圖7 普通小麥及其二倍體野生近緣種SPL17的DNA序列系統(tǒng)進化樹分析

在普通小麥中國春(CS)和衡觀 35(Heng)基因組DNA中均擴增到3種序列, 命名為TaSPL17-CS1、TaSPL17-CS2、TaSPL17-CS3和 TaSPL17-Heng1、TaSPL17-Heng2、TaSPL17-Heng3。在雙豐收(Shuang)基因組 DNA中擴增到 2種序列 TaSPL17-Shuang1和 TaSPL17-Shuang2。其中 TaSPL17-CS1、 TaSPL17-CS2、TaSPL17-Heng1、TaSPL17-Heng2、TaSPL17-Shuang1與小麥二倍體野生近緣種的SPL17-A2、SPL17-B2和SPL17-B1聚在同一個進化分枝中(圖 7), 而 TaSPL17-CS3、TaSPL17-Heng3、TaSPL17-Shuang2與SPL17-A3、SPL17-B3、SPL17-D聚在一起。SPL17-A1與普通小麥TaSPL17的序列相似性最低。

2.6 靶基因TaSPL17中tae-miR156識別位點的多態(tài)性

在本實驗室前期克隆的10個小麥TaSPL家族成員中, 僅TaSPL3和TaSPL17受tae-miR156調控。對TaSPL17基因結構及其在普通小麥和二倍體野生近緣種中的序列多態(tài)性分析結果表明：TaSPL17在普通小麥的A基因組供體種和B基因組供體種中均為多拷貝, 而在 D基因組供體種中可能為單拷貝,并且其在 3個野生近緣種中存在高度一致的序列,在六倍體普通小麥中也克隆到多種序列。本研究從300份普通小麥中根據單株穗數和基因型的多態(tài)性挑選出兩個小群體, 即SubP1和SubP2, 重點檢測靶基因中 tae-miR156識別位點的多態(tài)性, 為篩選優(yōu)異等位變異提供依據。小群體SubP1的單株穗數如圖8所示。利用引物miR-TaS擴增小麥TaSPL17的DNA序列, 擴增產物長度為 700 bp。每份材料至少檢測12個單克隆序列。測序結果表明在SubP1的31份材料和 SubP2的 30份材料中均未檢測到 TaSPL17中tae-miR156識別位點處存在變異的材料, 這表明TaSPL17中miR156識別位點高度保守。

圖8 SubP1群體材料的單株穗數

3 討 論

miRNA屬于小RNA的一種, 由RNA聚合酶II轉錄生成, 廣泛參與植物生長發(fā)育過程調控, 可以在不同層次上對靶基因進行調控, 包括轉錄、轉錄后和翻譯等[20]。miRNA靶基因大多為編碼調控蛋白的轉錄因子, 例如miR156的靶基因為SBP-box基因家族[21]、miR159/319的靶基因為MYB基因家族[22]、miR160的靶基因為ARF基因家族[23]、miR164的靶基因為NAC基因家族[24]、miR172的靶基因為AP2基因家族[25]。研究miRNA所調控的靶基因, 以及兩者的相互作用關系對于詮釋其功能至關重要。由于植物miRNA與其靶基因的互補程度較高, 也使得預測miRNA的靶基因更加方便可靠[26]。

SBP-box基因家族成員的多樣性使其能夠調控植物的眾多生長發(fā)育過程, 比如花的形成和發(fā)育[27,28]、葉片形狀及表皮性狀[21]、對環(huán)境信號的應答[29]、育性[30]和果實的成熟和產量[9]等。小麥是世界上最重要的糧食作物之一, 對其 miRNA156及其靶基因的研究具有十分重要的意義。本研究以普通小麥偃展4110為材料, 克隆了小麥tae-MIR156前體基因, 主要分為兩種序列, 與 miRbase數據庫中報道的序列相似, 經轉錄后均形成莖環(huán)結構, 3種序列中成熟tae-miR156所在臂的位置基本一致(圖2)。前人研究表明, 在擬南芥和水稻中各有11個AtSPL和OsSPL家族成員存在miR156識別位點, 大多數位于編碼區(qū), 少數位于非編碼區(qū)(UTR), 如擬南芥中的AtSPL3、AtSPL4和 AtSPL5, 水稻中的 OsSPL4和OsSPL13均位于3′-UTR區(qū)域[2,26,31]。然而, 在小麥的 10個 TaSPL基因中[15], 僅檢測到兩個成員TaSPL3和TaSPL17編碼區(qū)存在tae-miR156的靶位點(miRNA responsive element, MRE)(圖3)。其原因一方面可能是研究中所用的 10個 TaSPL基因[15]并不是小麥中所有的 SBP-box家族成員, 或者這 10個TaSPL基因并未包含全部的5′-UTR和3′-UTR區(qū)域,因此需要通過 5′-RACE和 3′-RACE獲得全長的UTR區(qū)域進一步確定; 另一方面也可能是由于小麥SBP-box基因受tae-miR156調控的模式與擬南芥和水稻中SBP-box基因家族成員不盡相同。

SBP-box基因早在綠藻和陸生植物的祖先分化之前就已經產生, 在其最后一個共同祖先分化之后,陸生植物的SBP-box基因就開始分化[7]。SBP-box靶基因中 miR156的識別位點普遍存在于陸生植物中, miRNA識別位點的保守性也說明了其與靶基因的相互作用對于植物生長發(fā)育的重要性。在苔蘚和石松門植物中, 僅有少數幾個 SBP-box基因受到miR156的調控; 然而被子植物(如擬南芥和水稻)的SBP-box基因家族成員中普遍存在miR156的識別位點[7]。在小麥的10個TaSPL基因中僅檢測到兩個成員的編碼區(qū)存在tae-miR156靶位點[15], 這是否暗示小麥SBP-box基因是由古老的SBP-box祖先基因進化而來, 并且在長期的進化過程中, 未獲得tae-miR156的識別位點, 有待進一步研究。

植物在長期的進化過程中, 基因或基因組的復制是普遍存在的現象, 這也是基因獲得新功能, 進而促使植物進化形成新物種的內在動力[32]。普通小麥是由A、B和D3個染色體組組成的異源六倍體物種, 從原始的二倍體物種進化到現代的六倍體, 普通小麥經歷了兩次異源多倍化過程。本研究以小麥tae-miR156靶向的 TaSPL17進行多態(tài)性分析, 以普通小麥偃展4110的cDNA為模板, 擴增獲得5種序列; 以小麥二倍體野生近緣種烏拉爾圖小麥(UR209)、擬斯卑爾脫山羊草(Y2001)和粗山羊草(Ae38)基因組DNA進行PCR擴增, 分別獲得3、3和1種序列(圖6, 表3)。因此, SPL17在普通小麥的A基因組供體種和B基因組供體種中均為多拷貝。并且SPL17-A2與SPL17-B2, SPL17-A3與SPL17-B3, SPL17-A3與SPL17-D和SPL17-B3與SPL17-D之間序列的一致性程度均大于 99%, 據此推測其可能來源于共同的祖先基因, 在進化過程中比較保守, 并且與普通小麥中克隆到的TaSPL17基因序列聚在一起, 屬于直系同源。而SPL17-A1與普通小麥中克隆到的TaSPL17基因序列關系最遠, 相似性最小(圖7)。另外, 本研究根據單株穗數和基因型的多樣性共挑選出61份材料, 均未檢測到tae-miR156識別位點的變異, 說明六倍體普通小麥 TaSPL17基因tae-miR156的識別位點非常保守。對44個SBP-box基因(包括16個AtSPL、18個OsSPL和10個TaSPL基因)的 SBP保守結構域氨基酸序列構建系譜進化樹, 小麥 TaSPL17與水稻的 OsSPL14和 OsSPL17,擬南芥的 AtSPL9和 AtSPL15聚在同一個進化分支上[15]。OsSPL14能夠調控水稻的株型, 提高產量; AtSPL9/15也參與調控花器官的形態(tài)建成并促進分枝[9,33]。我們的前期研究也表明, TaSPL17主要在莖的頂端分生組織和穗中表達, 并且其表達模式響應穗部發(fā)育[15], 這預示著 TaSPL17基因可能通過與tae-miR156的相互作用, 共同參與對小麥分蘗和穗部發(fā)育的調控, 相關研究正在進行中。

[1] Riese M, H?hmann S, Saedler H, Münster T, Huijser P. Comparative analysis of the SBP-box gene families in P. patens and seed plants. Gene, 2007, 401(1–2): 28–37.

[2] Chen XB, Zhang ZL, Liu DM, Zhang K, Li AL, Mao L. SQUAMOSA Promoter-Binding Protein-Like Transcription Factors: Star Players for Plant Growth and Development. J Integr Plant Biol, 2010, 52(11): 946–951.

[3] 許振華, 謝傳曉. 植物microRNA與逆境響應研究進展.遺傳, 2010, 32(10): 1018–1030.

[4] Huijser P, Schmid M. The control of developmental phase transitions in plants. Development, 2011, 138(19): 4117–4129.

[5] Wu G, Park MY, Conway SR, Wang JW, Weigel D, Poethig RS. The sequential action of miR156 and miR172 regulates developmental timing in Arabidopsis. Cell, 2009, 138(4): 750–759.

[6] Klein J, Saedler H, Huijser P. A new family of DNA binding proteins includes putative transcriptional regulators of the Antirrhinum majus floral meristem identity gene SQUAMOSA. Mol Gen Genet, 1996, 250(1): 7–16.

[7] Guo AY, Zhu QH, Gu XC, Ge S, Yang J, Luo JC. Genome-wide identification and evolutionary analysis of the plant specific SBP-box transcription factor family. Gene, 2008, 418(1–2): 1–8.

[8] Hultquist JF, Dorweiler JE. Feminized tassels of maize mop1 and ts1 mutants exhibit altered levels of miR156 and specific SBP-box genes. Planta, 2008, 229(1): 99–113.

[9] Wang SK, Wu K, Yuan QB, Liu XY, Liu ZB, Lin XY, Zeng RZ, Zhu HT, Dong GJ, Qian Q, Zhang GQ, Fu XD. Control of grain size, shape and quality by OsSPL16 in rice. Nat Genet, 2012, 44(8): 950–954.

[10] Jiao YQ, Wang YH, Xue DW, Wang J, Yan MX, Liu GF, Dong GJ, Zeng DL, Lu ZF, Zhu XD, Qian Q, Li JY. Regulation of OsSPL14 by OsmiR156 defines ideal plant architecture in rice. Nat Genet, 2010, 42(6): 541–544.

[11] Chang JZ, Zhang JN, Mao XG, Li A, Jia JZ, Jing RL. Polymorphism of TaSAP1-A1 and its association with agronomic traits in wheat. Planta, 2013, 237(6): 1495–1508.

[12] Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res, 2003, 31(13): 3406–3415.

[13] Gruber AR, Lorenz R, Bernhart SH, Neub?ck R, Hofacker IL. The vienna RNA websuite. Nucleic Acids Res, 2008, 36(S2): W70-W74.

[14] Dai X, Zhao PX. psRNATarget: a plant small RNA target analysis server. Nucleic Acids Res, 2011, 39(S2): W155-W159.

[15] Zhang B, Liu X, Zhao GY, Mao XG, Li A, Jing RL. Molecular characterization and expression analysis of Triticum aestivum SBP-box genes involved in ear development. J Integr Plant Biol, 2013, DOI: 10. 1111/jipb. 12153

[16] Letunic I, Doerks T, Bork P. SMART 7: recent updates to the protein domain annotation resource. Nucleic Acids Res, 2012, 40(D1): D302-D305.

[17] Kumar S, Nei M, Dudley J, Tamura K. MEGA: a biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences. Briefings Bioinf, 2008, 9(4): 299–306.

[18] Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell, 2004, 116(2): 281–297.

[19] 呂德康, 葛瑛, 柏錫, 李勇, 朱延明. 生物信息學在植物 miRNA 研究中的應用. 生物信息學, 2009, 7(2): 113–116, 136.

[20] Voinnet O. Origin, biogenesis, and activity of plant microRNAs. Cell, 2009, 136(4): 669–687.

[21] Yu N, Cai WJ, Wang S, Shan CM, Wang LJ, Chen XY. Temporal control of trichome distribution by microRNA156-targeted SPL genes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell, 2010, 22(7): 2322–2335.

[22] Reyes JL, Chua NH. ABA induction of miR159 controls transcript levels of two MYB factors during Arabidopsis seed germination. Plant J, 2007, 49(4): 592–606.

[23] Turner M, Nizampatnam NR, Baron M, Coppin S, Damodaran S, Adhikari S, Arunachalam SP, Yu O, Subramanian S. Ectopic expression of miR160 results in auxin hypersensitivity, cytokinin hyposensitivity, and inhibition of symbiotic nodule development in soybean. Plant Physiol, 2013, 162(4): 2042–2055.

[24] Mallory AC, Dugas DV, Bartel DP, Bartel B. MicroRNA regulation of NAC-domain targets is required for proper formation and separation of adjacent embryonic, vegetative, and floral organs. Curr Biol, 2004, 14(12): 1035–1046.

[25] Chen X. A microRNA as a translational repressor of APETALA2 in Arabidopsis flower development. Science, 2004, 303(5666): 2022–2225.

[26] Rhoades MW, Reinhart BJ, Lim LP, Burge CB, Bartel B, Bartel DP. Prediction of plant microRNA targets. Cell, 2002, 110(4): 513–520.

[27] L?nnenp?? M, J?n?nen I, H?ltt?-Vuori M, Gardemeister M, Porali I, Sopanen T. A new SBP-box gene BpSPL1 in silver birch (Betula pendula L.). Physiol Plant, 2004, 120(3): 491–500.

[28] Cardon GH, H?hmann S, Nettesheim K, Saedler H, Huijser P. Functional analysis of the Arabidopsis thaliana SBP-box gene SPL3: a novel gene involved in the floral transition. Plant J, 1997, 12(2): 367–377.

[29] Stone JM, Liang X, Nekl ER, Stiers JJ. Arabidopsis AtSPL14, a plant-specific SBP-domain transcription factor, participates in plant development and sensitivity to fumonisin B1. Plant J, 2005, 41(5): 744–754.

[30] Xing S, Salinas M, H?hmann S, Berndtgen R, Huijser P. miR156-targeted and nontargeted SBP-box transcription factors act in concert to secure male fertility in Arabidopsis. Plant Cell, 2010, 22(12): 3935–3950.

[31] Xie K, Wu C, Xiong L. Genomic organization, differential expression, and interaction of SQUAMOSA promoter-binding-like transcription factors and microRNA156 in rice. Plant Physiol, 2006, 142(1): 280–293.

[32] Adams KL, Wendel JF. Polyploidy and genome evolution in plants. Curr Opin Plant Biol, 2005, 8(2): 135–141.

[33] Schwarz S, Grande AV, Bujdoso N, Saedler H, Huijser P. The microRNA regulated SBP-box genes SPL9 and SPL15 control shoot maturation in Arabidopsis. Plant Mol Biol, 2008, 67(1): 183–195.

(責任編委: 夏先春)

Cloning of tae-MIR156 precursor gene and sequence polymorphisms of tae-miR156 targeted TaSPL17

Xia Liu1,2, Bin Zhang2, Xinguo Mao2, Ang Li2, Meirong Sun2, Ruilian Jing2

1. College of Bioengineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China;
2. National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Squamosa-promoter binding protein (SBP)-box genes, encoding plant-specific transcription factors, play an important role in plant development. Some members of the SBP-box gene family are regulated by miR156. In this study, we cloned the tae-MIR156 precursor gene, which could form a stem loop after its transcription. Sequence analysis showed thatTaSPL3 and TaSPL17 had putative targets of tae-miR156 among the ten wheat SBP-box genes. The diploid donor species of hexaploid common wheat (Triticum aestivum, genome AABBDD), i.e., Triticum urartu (AA) UR209 and Aegilops speltoides Y2001 (SS, closely related to BB) possessed more than one copy of SPL17 (SPL17-A1, SPL17-A2 and SPL17-A3 from Triticum urartu; SPL17-B1, SPL17-B2 and SPL17-B3 from Aegilops speltoides), while Aegilops tauschii (DD) Ae38 only possessed one (SPL17-D). The identities between nucleotide sequences of SPL17-A2 and SPL17-B2, SPL17-A3 and SPL17-B3 or SPL17-D were higher than 99%. They were highly similar with the sequence of TaSPL17 in common wheat cultivars Chinese Spring, Hengguan 35 and Shuangfengshou. These genes might originate from a common ancestor and were highly conserved in the process of evolution. The target site of tae-miR156 in TaSPL17 was also highly conserved in two subgroups consisted of accessions with diverse spike number per plant and genetic background.

miR156; SBP-box gene; polymorphism analysis; common wheat

2014-01-09;

2014-02-11

國家高技術研究發(fā)展計劃項目(863計劃)(編號：2012AA10A308)資助

劉霞, 碩士研究生, 專業(yè)方向：小麥基因資源發(fā)掘。E-mail: liuxia1214lx@163.com

景蕊蓮, 博士, 研究員, 研究方向：作物抗逆生物學。E-mail: jingruilian@caas.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0592

時間: 2014-5-6 15:13:00

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140506.1513.004.html