屠平光，項(xiàng) 云，章嘯君，樓芳芳

(金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江金華321000)

成纖維細(xì)胞是結(jié)締組織中最常見的細(xì)胞，特征為生長較快、細(xì)胞和細(xì)胞核較大，顯微鏡下可觀察到清晰輪廓，呈典型梭形、星形或多邊形，細(xì)胞核為卵圓形［1］。目前，成纖維細(xì)胞被廣泛用于生產(chǎn)體細(xì)胞克隆豬［2－3］、轉(zhuǎn)基因豬及制作豬誘導(dǎo)多功能性干細(xì)胞［4－5］。

金華豬是我國優(yōu)良地方豬種，體型中等偏小，具有基因較純、遺傳性穩(wěn)定、表型均一和遺傳背景清楚等優(yōu)點(diǎn)，是目前生物醫(yī)學(xué)、異種器官移植、人類疾病模型建立等領(lǐng)域研究的理想材料。由于動(dòng)物遺傳資源能夠以細(xì)胞系的方式保存［5］，因此優(yōu)化培養(yǎng)體系，建立穩(wěn)定的金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞系，可以使金華豬這一寶貴的遺傳資源在細(xì)胞學(xué)水平上得到長期保存，為體細(xì)胞核移植、轉(zhuǎn)基因和異種器官移植等相關(guān)研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)采用組織塊貼壁法培養(yǎng)金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞，并在不同血清濃度下，觀察其對(duì)金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞體外生長的影響，為進(jìn)一步改進(jìn)其培養(yǎng)技術(shù)、篩選更好的細(xì)胞培養(yǎng)體系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 培養(yǎng)基(DMEM)，胎牛血清(FBS)，青霉素、鏈霉素混合液(含青霉素10000 u/mL、鏈霉素10 μg/mL);0.25%胰蛋白酶溶液，PBS液均為Hyclone 公司產(chǎn)品。

倒置顯微鏡OLYMPASCKX41;二氧化碳培箱Thermo311 型;酶標(biāo)儀伯樂680 型。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 取材 采集金華豬耳緣組織浸入PBS 液中，置實(shí)驗(yàn)室無菌操作臺(tái)，用75%酒精浸泡45 s 后，放入含雙抗的PBS 液中漂洗數(shù)次，以確保組織無菌。

1.2.2 組織塊貼壁培養(yǎng)法 將組織塊置于培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)液，用眼科剪刀反復(fù)剪切組織塊，剪成1 mm3大小的小塊。用眼科鑷子將組織小塊在無菌60 mm 培養(yǎng)皿中均勻擺放，間距約0.3 cm。放置后，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，倒置放入37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h 后，待培養(yǎng)皿中組織半干貼附后，慢慢翻轉(zhuǎn)平放培養(yǎng)皿，輕輕加入含5%、10%、15%血清的培養(yǎng)基中，注意防止組織塊漂浮，標(biāo)記后放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。2 d 后取出，置于倒置顯微鏡下觀察組織塊遷移率，同時(shí)進(jìn)行換液［6］。

1.2.3 傳代培養(yǎng) 待原代細(xì)胞匯合成片，約占培養(yǎng)皿底面積80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代前24 h 內(nèi)更換新鮮培養(yǎng)液。取出培養(yǎng)皿后，置于無菌操作臺(tái)內(nèi)，倒棄原培養(yǎng)液，加入2 mL PBS 液清洗細(xì)胞2 次后，在培養(yǎng)皿中加入消化液0.5 mL，輕輕振蕩，倒置顯微鏡下觀察，待大部分細(xì)胞變圓、漂浮后，在培養(yǎng)皿中加入4 mL 培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打，使細(xì)胞分散。以1000 r/min、離心5 min，棄上清液，再加入2 mL 培養(yǎng)液吹打重懸浮細(xì)胞，再次以1000 r/min 、離心5 min，棄上清液，以2 mL 培養(yǎng)液吹打重懸浮細(xì)胞，使用血球計(jì)數(shù)板和0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度為2 ×105個(gè)/mL。隨后，接入新培養(yǎng)皿中，置37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 耳緣成纖維細(xì)胞純化 成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的敏感度不同，成纖維細(xì)胞對(duì)消化液較上皮細(xì)胞敏感，合適時(shí)間可以使成纖維細(xì)胞脫壁，而上皮細(xì)胞則仍然貼在瓶壁上。

經(jīng)過2～3 次消化傳代后即可得到純化的成纖維細(xì)胞。

1.4 MTT 法檢測血清濃度對(duì)細(xì)胞數(shù)量的影響 用傳代培養(yǎng)的第3 代細(xì)胞胰酶消化，分別用含不同濃度的血清配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1 ×104個(gè)/mL細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，每組10 孔，培養(yǎng)2 d后，取出培養(yǎng)板進(jìn)行檢測。

每孔加入MTT 溶液(5 g/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后終止培養(yǎng)，輕輕吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇波長490 nm，用酶標(biāo)儀測定各孔光吸收值(A 值)。

1.5 數(shù)據(jù)處理 對(duì)不同濃度血清培養(yǎng)的金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞的MTT 結(jié)果，采用方差分析。

不同組別數(shù)據(jù)間比較采用t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 倒置顯微鏡觀察結(jié)果 采用組織塊貼壁培養(yǎng)法血清濃度為10%與15%時(shí)，培養(yǎng)4 d 后即有細(xì)胞沿組織塊周圍生長出現(xiàn)(圖1－1)，培養(yǎng)8 d 后成纖維細(xì)胞呈優(yōu)勢生長狀態(tài)(圖1－2)，培養(yǎng)13 d 左右即可長滿培養(yǎng)瓶底(圖1－3)。血清濃度為5%時(shí)，4 d 后未見細(xì)胞沿組織塊周圍出現(xiàn)，10 d 后才見少量細(xì)胞沿組織塊周圍出現(xiàn)，21 d 左右才鋪滿培養(yǎng)瓶底。

細(xì)胞經(jīng)2～3 次消化傳代后即可得到純化的成纖維細(xì)胞，細(xì)胞呈梭形、三角形，為典型的成纖維形態(tài)，胞質(zhì)近中央處有橢圓形胞核。成群細(xì)胞呈束狀、漩渦狀(圖1－4)。

圖1 組織塊貼壁培養(yǎng)法成纖維細(xì)胞生長態(tài)勢

2.2 MTT 檢測結(jié)果 金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞在10%、15%血清培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長旺盛，活力較強(qiáng)，差異不顯著(P ＞0.05);在5%血清培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長緩慢，細(xì)胞活力明顯低于10%與15%血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞，差異顯著(P ＜0.05)。詳見表1。

表1 3 種濃度血清培養(yǎng)的細(xì)胞光密度值

3 小結(jié)與討論

本次試驗(yàn)，采用組織塊貼壁方法培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞形態(tài)良好，且在細(xì)胞傳代后極少出現(xiàn)無法貼壁的死細(xì)胞，穩(wěn)定傳代10 次后，細(xì)胞形態(tài)未出現(xiàn)衰老等變化，長滿90%左右時(shí)，成群細(xì)胞呈束狀或漩渦狀生長。

據(jù)本次試驗(yàn)，10%～15%胎牛血清濃度即可滿足金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞的生長需求，且10%、15%血清濃度對(duì)細(xì)胞生長影響的差異不顯著。所以采用10%血清濃度培養(yǎng)金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞可以完全滿足實(shí)驗(yàn)需要。血清濃度為5%時(shí)，則不能滿足細(xì)胞生長需要，雖細(xì)胞仍在生長，但速度較慢，培養(yǎng)器皿底部尚未鋪滿，細(xì)胞一直處于增殖狀態(tài)，但未出現(xiàn)平臺(tái)期。

綜上所述，血清濃度對(duì)金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞生長影響比較明顯，血清濃度為10%、15%時(shí)，二者對(duì)細(xì)胞生長狀況的影響差異不顯著(P ＞0.05)，二者與血清濃度為5%時(shí)對(duì)生長狀況的影響，則差異顯著(P ＜0.05)，表明不同血清濃度的培養(yǎng)體系在對(duì)體外培養(yǎng)金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞有著明顯影響。

血清是一種很復(fù)雜的混合物，含有豐富的細(xì)胞生長必須的營養(yǎng)成分，能維持細(xì)胞成活，促進(jìn)細(xì)胞增殖?？赡芘c血清中所含VEGF、EGF、bFGF 等多種細(xì)胞生長因子有關(guān)，細(xì)胞生長因子對(duì)細(xì)胞增殖影響均存在一定的量效關(guān)系［7］。因此，筆者認(rèn)為在血清濃度為10%條件下采用組織塊貼壁培養(yǎng)法獲取的原代金華豬耳緣組織成纖維細(xì)胞形態(tài)良好、增殖能力較強(qiáng)，群體倍增時(shí)間較短。

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