嚴艷紅

【摘要】目的:研究實時定量PCR與痰涂片檢查在肺結(jié)核診斷中的臨床價值。方法:收集120份痰液標本，通過實時定量PCR與痰涂片同步檢測，比較兩組方法的陽性率、靈敏性和特異性。結(jié)果:本組80份確診標本中涂片法陽性率為31.25%(25/80)，F(xiàn)Q-PCR法陽性率為68.75%(55/80)。涂片法的靈敏度和特異度分別為31.25%和95%，F(xiàn)Q-PCR法為68.75%和90%。結(jié)論:FQ-PCR法和涂片法在結(jié)核病的診斷中具有各自的優(yōu)勢，是結(jié)核病實驗診斷的重要手段，應(yīng)根據(jù)實際情況選擇合適的檢查方法。

【關(guān)鍵詞】結(jié)核??；實時定量PCR；痰涂片

【中圖分類號】R722.12 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949(2014)06-0195-02

結(jié)核病的發(fā)病是由結(jié)核桿菌感染造成的，在世界范圍內(nèi)一直是威脅人類健康的一類傳染病，近年來，由于環(huán)境污染、AIDS的傳播和結(jié)核桿菌耐藥性的提高，結(jié)核病的發(fā)病率呈上升趨勢，對我國來說，結(jié)核病負擔尤其重，因此各醫(yī)療組織積極研究和探討結(jié)核病的早期診斷以及治療方案，以達到控制病情的目的，本研究主要比較痰涂片檢查和FQ-PCR熒光定量法在結(jié)核病診斷中的臨床價值。

1材料與方法

1.1標本來源

120份供研究標本來源于我疾控中心結(jié)核病門診部疑似結(jié)核病患者的晨痰標本，患者資料為男57例，女63例，年齡19~72歲。取0.5ml 痰標本加入2倍樣本體積4%的NaOH，液化10min后15000r/min離心5min，去上清液；向沉淀中加入0.5ml 滅菌水，充分振蕩混勻，15 000r/min離心2min，去上清液，重復(fù)洗滌3次；沉淀中加入50 ul DNA提取液(1%NP-40 +2%Triton X-100)，充分振蕩混勻，100℃水浴10min；待冷卻至室溫，15 000r/min離心5min，取上清液備用。

1.2儀器與試劑

Heraeus低溫冷凍離心機Megafuge 1.0R、Biospec-mini DNA/RNA/Protein analyzer(島津)、7500熒光定量PCR擴增儀(Applied Biosystems)、凝膠成像系統(tǒng)(英國UVI tec)、結(jié)核分枝桿菌(TB)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)。

1.3檢測方法

對臨床送檢的120份痰液標本，通過實時定量PCR與痰涂片同步檢測。涂片法按照有關(guān)的實驗操作規(guī)程進行，鏡檢顯示每100個視野有3-9條抗酸桿菌為陽性［1］。FQ-PCR法按照試劑盒說明操作，以陰陽性質(zhì)品控及陽性定量參考品的Ct值進行結(jié)果判定。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，兩組間比較采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1涂片法與FQ-PCR法檢查結(jié)果：涂片染色法陽性檢出率為22.5%(27/120)，熒光定量PCR法陽性檢出率49.17%(59/120)，顯著高于抗酸染色法，漏檢率低。對抗酸染色法陽性的樣本，熒光定量PCR法的靈敏度分別為100%。

2.2本組120份標本共80份確診為結(jié)核病，在確診標本中涂片法陽性率為31.25%(25/80)，F(xiàn)Q-PCR法陽性率為68.75%(55/80)。

2.3靈敏性與特異性。涂片法的靈敏度和特異度分別為31.25%和95%，F(xiàn)Q-PCR法的靈敏度和特異度分別為68.75%和90%。

3 討論

在以往的一段時期，對于結(jié)核病的實驗室診斷方法一般是通過痰涂片檢查和培養(yǎng)檢查。痰涂片檢測的優(yōu)點在于能夠發(fā)現(xiàn)結(jié)核 傳染源，并且費用低，可以節(jié)省支出，操作較為方便，能夠快速顯示結(jié)果，然而缺點在于敏感性不理想，受痰標本桿菌濃度、實驗操作人員技術(shù)水平和實驗室條件影響較大，且無法辨別死菌還是活菌。在本研究80份確診為結(jié)核病的標本中，涂片法陽性率為31.25%(25/80)。

在分子生物學研究突飛猛進的條件下，結(jié)核病的實驗室診斷越來越多的采用PCR技術(shù)，本研究中即采用FQ-PCR熒光定量法來診斷結(jié)核病。研究發(fā)現(xiàn)PCR在結(jié)核病檢查中存在定性技術(shù)特異性差 的問題，造成假陽性或假陰性等結(jié)果，而FQ-PCR熒光定量法很好的彌補了這一缺陷，且污染較小，自動化程度更高。FQ-PCR熒光定量法的原理在于利用一對結(jié)核分枝桿菌特異性引物和一條結(jié)核分枝桿菌特異性熒光探針，配以PCR反應(yīng)液，耐熱DNA聚合酶(Taq酶)，四種核苷酸單體(dNTPS)等成分，用體外擴增法檢測結(jié)核分枝桿菌基因。該方法的檢測對象是結(jié)核分枝桿菌基因保守片段，動態(tài)檢測標本中結(jié)核桿菌DNA含量，不受細胞表型和耐藥性影響，具有較高靈敏度和特異性［2］。本研究中的80份確診為結(jié)核病的標本，經(jīng)FQ-PCR法檢查結(jié)果顯示陽性率為68.75%(55/80)，與痰涂片檢查比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

造成假陽性結(jié)果的原因分析：樣品間的污染和擴増產(chǎn)物的污染、樣品間的交叉污染最易發(fā)生在樣品的處理過程之中。要避免擴增物的污染，理想的方法是縮短操作的時間， 簡化操作手續(xù)并使用一次性離心管及帶濾芯的槍頭。造成假陰性的結(jié)果的原因分析：主要由于各種原因引起的酶活性降低、模板量太少、以及引物作用受到影響等三個方面的因素。本研宄所使用的試劑盒中采用了酶防污染系統(tǒng)，以降低各種因素對酶活性的影響。

總體來看，F(xiàn)Q-PCR法用于結(jié)核病診斷，其特異性和靈敏度明顯高于涂片法，且操作簡便，只需2 h～3 h就可以完成，對于結(jié)核病尤其是肺外結(jié)核的診斷具有較高的應(yīng)用價值。而涂片法作為結(jié)核病最基本的細菌學檢查方法，它所具有的直觀、簡便、價廉等優(yōu)點，仍將是結(jié)核病實驗室診斷的重要手段。

參考文獻

［1］王怡云.痰涂片檢查結(jié)核分枝桿菌規(guī)范化操作及改良安全抗酸染色法介紹［J］.衛(wèi)生職業(yè)教育. 2009(23)

［2］肖慧霞,王曉平,王福銳,劉曉妮.熒光定量PCR技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌檢測中的應(yīng)用［J］.寧夏醫(yī)學雜志. 2011(02)