付亭亭 綦文濤 李愛科， 劉建學 梁新曉 贠婷婷 王永偉

（河南科技大學食品與生物工程學院1，洛陽 471000）

（國家糧食局科學研究院2，北京 100037）

豆粕中的棉籽糖和水蘇糖分別占大豆可溶性糖類的5.2%～15.8%和12.1%～35.2%[1]，因其能夠引起動物尤其是幼齡動物的脹氣、腹瀉、腹痛等癥狀[2]，同時很難通過簡單的加熱或加工除去[3]，而極大的限制了豆粕的推廣應用。目前，公認最有前景的方法是通過酶降解或微生物發(fā)酵等生物技術手段進行消減或者徹底去除。微生物發(fā)酵豆粕時所產生的豐富酶系，不僅能將豆粕中的水蘇糖和棉籽糖降解為可供微生物利用的單糖[4]，而且也可將豆粕中的其他抗營養(yǎng)因子降解。因此，相關研究也越來越受到關注。目前豆粕中棉籽糖和水蘇糖的常用檢測方法多為HPLC法，但已報道的HPLC法還存在檢測時間較長，精度不夠等問題，不適合于日?？焖贆z測。除此之外，發(fā)酵豆粕還存在很多的不足，如在動物上的應用研究還不夠細致，發(fā)酵產品的差異也比較大，所采用菌種多種多樣，但功效不明確等。因此，優(yōu)良菌種的篩選，不同菌種的抗營養(yǎng)因子降解效果檢驗和標準化的產品評價方法仍是發(fā)酵豆粕下一步研究的重點。

基于上述問題，本研究在建立準確、快速水蘇糖和棉籽糖檢測方法的基礎上，以豆粕為來源，通過固態(tài)發(fā)酵的方法，以微生物的增殖活性、發(fā)酵豆粕的感官評價及水蘇糖和棉籽糖的降解情況等為評價指標，篩選出具有應用潛力的優(yōu)良菌株和復配方案，為發(fā)酵豆粕的準確評價和穩(wěn)定產品的開發(fā)打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

YPD培養(yǎng)基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，蒸餾水 1 L，115℃滅菌25 min。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 L，121℃滅菌25 min。

MRS培養(yǎng)基：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，酵母浸膏5 g，磷酸鉀2 g，檸檬酸氫二銨2 g，無水乙酸鈉 5 g，Tween 80 1 mL，硫酸鎂 0.58 g，硫酸錳 0.25 g，蒸餾水1 L，pH 6.2～6.8，115℃滅菌30 min。

牛肉膏蛋白胨酪蛋白選擇培養(yǎng)基：氯化鈉5 g，干酪素3 g，10%乳酸適量，瓊脂20 g，蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，蒸餾水1 L，121℃滅菌25 min。

棉籽糖標準品：經科宏達；水蘇糖標準品：TIC公司，2種糖純度均大于98%。乙腈為色譜純試劑：Dikma公司；Milli-Q50超純水處理器：Millipore公司。

UV-2102紫外-可見分光光度計：美國尤尼柯儀器有限公司；PRX-350B智能人工氣候箱：寧波海曙賽福實驗儀器廠；HSP-400生化培養(yǎng)箱：哈爾濱東聯電子技術開發(fā)有限公司；Mini Spain高速離心機：美國Eppendorf；粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；60目分樣篩：浙江上虞市公路儀器廠；高效液相色譜系統(tǒng)：Waters。

1.2 試驗方法

1.2.1 HPLC檢測水蘇糖和棉籽糖方法的建立

1.2.1.1 色譜條件的建立

采用Waters 2410示差折光檢測器，色譜柱采用日本島津公司Inertsil NH2柱（4.6 mm×250 mm i.d.，5μm）；流動相為乙腈∶水為 65∶35（V／V）；流速1.0 mL／min；柱溫35℃，檢測器溫度為40℃。

1.2.1.2 水蘇糖和棉籽糖檢測線性范圍的確定

配制 2.00、2.50、4.00、5.00、6.00、8.00、10.00 mg／mL的棉籽糖標準品溶液和4.00、8.00、10.00、12.00、16.00、20.00、40.00 mg／mL的水蘇糖標準品溶液。根據測定的峰面積（A，mV／s）和對應的糖質量濃度（c，mg／mL）進行線性回歸，分別得到棉籽糖和水蘇糖的標準曲線方程。

1.2.1.3 HPLC測定

吸取10.50 mg／mL的水蘇糖和2.00 mg／mL的棉籽糖標準品溶液，重復進樣5次，以測得的峰面積（A，mV／s）為指標，測定檢測方法的重現性[5]。

取供試樣品5份，每份1.50 g，按照樣品提取工藝處理，檢測所建色譜條件用于樣品檢測時的可重復性[6]。

1.2.1.4 HPLC檢測法的回收率試驗

取已知含量的樣品1.00 g，分別定量加入水蘇糖和棉籽糖標準品，按照樣品處理方法處理樣品，進樣測定并計算，計算水蘇糖和棉籽糖的平均加樣回收率。

1.2.2 菌種的篩選和鑒定

1.2.2.1 菌種的來源

本試驗所使用的菌種一部分來源于實驗室保藏菌種，另一部分從豆粕中篩選而來。

1.2.2.2 菌種的篩選

取豆粕樣品10.0 g，放入帶有玻璃珠的三角瓶中，加90mL生理鹽水，震搖20 min，使樣品與生理鹽水充分混合均勻。之后將懸液制成10-9～10-1不等的稀釋度樣品液，然后將其涂布在牛肉膏蛋白胨酪蛋白培養(yǎng)基上，置于30℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1～3 d，觀察[7]。從其中挑選出能夠在培養(yǎng)基上生長且能夠產生透明水解圈的菌株。以產蛋白酶能力為指標，篩選出可用菌株。

1.2.2.3 菌種的鑒定

通過顯微鏡下菌體觀察、芽孢檢測以及16S rRNA序列分析來鑒定菌種名稱。

1.2.2.4 菌種的生長曲線測定方法

將菌種分別從斜面固體培養(yǎng)基接種于相應的液體培養(yǎng)基中，并于30℃（酵母菌）、37℃（枯草芽孢桿菌和屎腸球菌）200 r／min搖床培養(yǎng)，每隔2 h取樣，測定培養(yǎng)液的OD600，使用未接種的培養(yǎng)液做空白對照。

1.2.3 豆粕的固態(tài)發(fā)酵工藝

準確稱取豆粕 45 g，以 9∶0.5∶0.5（豆粕∶玉米粉∶麩皮）的比例加入麩皮和玉米粉，以15%的接種量，料水比為1∶0.8，30℃發(fā)酵48 h后，50℃干燥3 h，粉碎過篩即可。

1.2.4 發(fā)酵豆粕感官分析

豆粕經過上述條件發(fā)酵后，通過眼觀、鼻聞等方法對發(fā)酵豆粕的顏色、氣味及黏度。稱取10.00 g樣品于平皿中進行感官評價，評價標準參考 NY／T 22182012中對發(fā)酵豆粕中的要求。

1.2.5 樣品處理

稱取過60目篩的樣品0.15 g，準確至0.000 1 g，加入50%的乙腈1.5mL，超聲輔助提取45 min，溫度為40℃。以4 000 r／min離心10 min，取上清液經0.45μm濾膜過濾[8]。用 HPLC分析其中水蘇糖和棉子糖的含量。

1.2.6 數據處理

數據處理采用EXCEL和SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進行處理，各組間均數差異性比較采用的是One-Way ANOVA方法，顯著性水平P＜0.05。水蘇糖和棉子糖含量分析采用的是Waters公司Empower 2色譜工作站，測定出目標峰峰面積之后，帶入標準曲線計算其含量。

2 結果與分析

2.1 HPLC檢測水蘇糖和棉籽糖方法的建立

2.1.1 水蘇糖和棉籽糖HPLC檢測方法的有效性

圖1為水蘇糖和棉子糖標準品的HPLC色譜圖，由圖1可見本研究所建立的色譜條件可以使水蘇糖和棉子糖標準品有效分離，分離效果良好，二者的出峰時間（Retention Time，RT）分別為12.6、8.6 min，整個分析過程可在15 min內完成。

圖1 水蘇糖和棉籽糖標準品色譜圖

2.1.2 HPLC檢測水蘇糖和棉籽糖的線性范圍

以峰面積（A，mV／s）為橫坐標，濃度（c，mg／mL）為縱坐標制作標準曲線，得到圖2和圖3。圖2和圖3分別為水蘇糖和棉子糖的標準曲線。對所得數據進行線性回歸，分別得到水蘇糖和棉籽糖的標準曲線方程為：

圖2 水蘇糖標準曲線

圖3 棉籽糖標準曲線

水蘇糖線性方程：c＝8×10-6A＋0.380

棉籽糖線性方程：c＝9×10-6A＋0.269

結果表明：棉籽糖的檢測范圍為2.00～10.00 mg／mL，水蘇糖的檢測范圍為 4.00～40.00 mg／mL，且棉籽糖和水蘇糖在其檢測范圍內線性良好。

2.1.3 HPLC檢測水蘇糖和棉籽糖的精密度

吸取10.50 mg／mL的水蘇糖和2.00 mg／mL的棉籽糖標準品溶液，重復進樣5次[9]，以測得的峰面積（A，mV／s）為指標，得水蘇糖的 RSD為 0.89%（n＝5），棉籽糖的 RSD為0.81%（n＝5）。

2.1.4 HPLC檢測水蘇糖和棉籽糖的回收率

取已知含量的樣品1.00 g，分別定量加入水蘇糖和棉籽糖標準品，按照樣品處理方法處理樣品，進樣測定并計算，得出水蘇糖的平均加樣回收率為95.68%，棉籽糖的平均加樣回收率為95.08%，試驗結果見表1。

表1 方法回收率（n＝5）

由以上數據可以得出，本試驗所采用的HPLC檢測水蘇糖和棉籽糖方法適合于水蘇糖和棉籽糖的準確、快速定量。

2.2 菌種的篩選和鑒定

2.2.1 菌種的篩選

優(yōu)良的菌種是固態(tài)發(fā)酵豆粕的基礎，而菌株的蛋白酶活性的高低是利用其進行固態(tài)發(fā)酵所要考慮的首要因素。本研究以產蛋白酶能力和固態(tài)發(fā)酵時微生物細胞的增殖能力為考核指標，通過稀釋平板涂布法篩選出具有應用潛力的發(fā)酵豆粕菌株。表2為初步篩選出的6株菌的菌落形態(tài)。其中菌株A1和B1呈光滑圓潤的乳白色菌落形態(tài)，并能夠形成顯著的蛋白水解圈（如圖4），具有很好的蛋白酶生成能力。

表2 分離純化菌株在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖4 A1和B1產生的水解圈

圖5 A1和B1的生長曲線

以牛肉膏培養(yǎng)基為培養(yǎng)基質，每隔2小時取樣，繪制了A1和B1的生長曲線。由圖5可知，菌株A1和B1在液體培養(yǎng)基中生長的延遲期均較短，且生長速率較高。其中，A1和B1的對數生長期分別在2～20 h和2～14 h，生長穩(wěn)定期分別為20 h和14 h。因此，A1和B1的最佳接種齡分別為16～20 h和10～14 h。

為了進一步考察A1和B1能否充分的利用豆粕生長繁殖，對這兩株菌發(fā)酵豆粕前后的活菌數進行了測定，結果見圖6。

圖6 A1和B1發(fā)酵豆粕前后活菌數

從圖6可以得出，發(fā)酵前后菌株A1和B1的活菌數分別增加了3.6倍和3倍。因此，所篩得菌株均可以利用豆粕作為底物生長繁殖。

2.2.2 菌種的鑒定

將篩得菌株的16S rRNA基因序列分析測序結果通過BLAST與GenBank里收錄的細菌16S rRNA基因序列進行對比，發(fā)現菌株A1與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）同源相似度達到了99.0%；B1與屎腸球菌（Enterococcus faecium）的同源相似度達到了99.0%。根據兩株細菌的顯微形態(tài)及菌落形態(tài)，結合16S rRNA序列分析，確定菌株A1和B1分別為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和屎腸球菌（Enterococcus faecium）。

A1的16S rRNA基因序列分析部分堿基片段如圖7所示。

圖7 A1菌株部分DNA序列

B1的16S rRNA基因序列分析部分堿基片段如圖8所示。

圖8 B1菌株部分DNA序列

2.3 不同菌種發(fā)酵豆粕的感官評價與水蘇糖、棉子糖降解分析

由于混合菌種發(fā)酵同時具有提高蛋白含量，彌補單一菌種發(fā)酵的不足，降低抗營養(yǎng)因子等多重優(yōu)點，因此在發(fā)酵豆粕領域混合菌種發(fā)酵較單一菌種發(fā)酵更具有優(yōu)勢。本研究采用實驗室保存菌株（包括產朊假絲酵母（CU1）、8605酵母粉）和篩選菌株枯草芽孢桿菌和屎腸球菌分別進行了豆粕單一菌種和混合菌種固態(tài)發(fā)酵，在對發(fā)酵后產品進行感官評價的基礎上，利用本研究所建立方法，測定了發(fā)酵后豆粕中的水蘇糖和棉籽糖的降解情況，結果如表3所示。

通過感官性狀的分析發(fā)現，本試驗所采用的菌株發(fā)酵豆粕后均為黃色或淺黃色。屎腸球菌或產朊假絲酵母單一菌種發(fā)酵后豆粕均具有酸香味，兩者混合發(fā)酵后酸香味更加濃郁。由于篩選的菌種屎腸球菌和枯草芽孢桿菌均有高產蛋白酶活性，因此發(fā)酵后豆粕黏度較大。產朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌以及屎腸球菌混合發(fā)酵后，豆粕不僅顏色金黃，酸香味濃郁，而且黏度較大，符合優(yōu)質發(fā)酵豆粕的感官要求。

表3 豆粕及發(fā)酵豆粕的產品評價結果／%（n＝5）

在對發(fā)酵豆粕進行感官評價之后，使用上述建立色譜條件，對發(fā)酵豆粕中的水蘇糖和棉籽糖進行檢測，發(fā)現發(fā)酵豆粕中的水蘇糖和棉籽糖能與樣品中的其他組分在20 min內有效分離，且峰形較好，如圖9和圖10所示。所得RSD為1.95%（n＝5），表明所建檢測方法可以準確的用于發(fā)酵豆粕中水蘇糖和棉子糖的檢測分析。

圖9 發(fā)酵前樣品色譜圖

圖10 發(fā)酵后樣品色譜圖

從表3中可知，酵母菌CU1和8605單一菌種發(fā)酵后可將豆粕中的水蘇糖和棉籽糖完全降解。這一結果與 Cavazzoni等[10]的研究結果一致。Cavazzoni證明了假絲酵母能夠在以棉籽糖為唯一碳源的礦物培養(yǎng)基中產生A和B 2種α-半乳糖苷酶，其中A型在pH和溫度適宜的情況下能將培養(yǎng)基中的棉籽糖完全降解。產朊假絲酵母混合枯草芽孢桿菌或屎腸球菌所得發(fā)酵豆粕具有良好的感官性狀，并且其中水蘇糖和棉子糖等抗營養(yǎng)因子完全降解。與之相比，酵母8605在與枯草芽孢桿菌和屎腸球菌混合發(fā)酵時，能將水蘇糖完全降解，棉籽糖部分降解。這可能是因為枯草芽孢桿菌或屎腸球菌競爭抑制了酵母的生長，而枯草芽孢桿菌的生長繁殖過程不需要糖的存在，其對糖的利用率很低，因此當酵母與枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵豆粕時，對低聚糖的降解沒有單純使用酵母發(fā)酵的效果好。

屎腸球菌發(fā)酵豆粕的過程中，優(yōu)先利用較容易吸收的蔗糖，之后會部分的分解利用水蘇糖[11]，在整個發(fā)酵過程中，隨著屎腸球菌的生長繁殖培養(yǎng)基的pH會逐漸減少到5.0以下，而Mital等[12]證明了乳酸菌所產生的α-半乳糖苷酶類的活性范圍在pH 4.5～8.0，這就導致了豆粕中的水蘇糖和棉籽糖被部分分解，而不是被完全降解。

由于多菌種混和發(fā)酵豆粕后，不同微生物產生的混合酶系豐富，能將豆粕中大分子的蛋白降解為小分子的寡肽，使豆粕中的抗營養(yǎng)因子，如胰蛋白酶抑制因子、脲酶、水蘇糖、棉籽糖以及抗原蛋白等被完全降解，顯著提高了豆粕的適口性和消化率[13]。然而多菌種混合發(fā)酵的綜合作用是單一菌種所不能完成的，因此混合菌種發(fā)酵豆粕更具有應用潛力。

3 結論

3.1 建立了20 min內能將發(fā)酵豆粕中的水蘇糖和棉籽糖準確檢測HPLC法，在該方法下水蘇糖和棉籽糖的檢測限分別為4.00～40.00 mg／mL和2.00～10.00 mg／mL，平均加樣回收率分別為95.68%和95.08%，滿足對豆粕中水蘇糖和棉籽糖的檢測要求，適合于發(fā)酵豆粕的日常檢測。

3.2 篩選出了具有發(fā)酵豆粕應用潛力的枯草芽孢桿菌和屎腸球菌。并對不同菌種單一菌種和混合菌種發(fā)酵后豆粕中水蘇糖和棉籽糖的降解效果進行了評價，結果表明酵母菌CU1和8605單菌發(fā)酵后可將豆粕中的水蘇糖和棉籽糖完全降解?？莶菅挎邨U菌和屎腸球菌單一菌種發(fā)酵后可將水蘇糖和棉籽糖部分降解。

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