蒼耳子提取物對(duì)斑馬魚的發(fā)育及運(yùn)動(dòng)行為的毒性研究

陳錫強(qiáng)，侯海榮，劉可春，王希敏，彭維兵，韓利文，王雪，陳維云

（山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014）

蒼耳子提取物對(duì)斑馬魚的發(fā)育及運(yùn)動(dòng)行為的毒性研究

陳錫強(qiáng)，侯海榮，劉可春*，王希敏，彭維兵，韓利文，王雪，陳維云

（山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014）

為研究蒼耳子提取物對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育及運(yùn)動(dòng)行為的影響，取受精后12／24 h斑馬魚胚胎，將胚胎分別置于不同濃度蒼耳子提取物溶液中，在作用不同時(shí)間后，顯微鏡下統(tǒng)計(jì)孵化率、死亡率和心率；取受精后120 h斑馬魚胚胎，用不同濃度蒼耳子提取物處理60 min后，利用行為學(xué)分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)各組斑馬魚在0～10、10～20、20～30 min內(nèi)行為軌跡，基于游行距離與游行時(shí)間得到游行速度，并統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)圈值。結(jié)果表明，蒼耳子提取物對(duì)受精后12 h斑馬魚胚胎的發(fā)育有毒性，使斑馬魚胚胎的孵化率降低，在提取物濃度大于15μg／mL時(shí)，孵化率低于40%；0.93μg／mL蒼耳子提取物可提高24 h斑馬魚胚胎的心率（P≤0.01），當(dāng)提取物濃度大于7.5μg／mL時(shí)，心率顯著性降低（P≤0.01）；在行為學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蒼耳子提取物濃度大于3μg／mL時(shí)，游行速度與轉(zhuǎn)圈均值明顯增加。研究認(rèn)為，蒼耳子提取物對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育有毒性作用，能夠興奮斑馬魚胚胎心率并增加其游行速度。

蒼耳子；斑馬魚；發(fā)育；運(yùn)動(dòng)行為；毒性研究

Key words：Fructus Xanthii；zebrafish；grow th；motion behavior；toxicity

蒼耳子為菊科植物蒼耳（Xanthium sibiricumPatr.）的干燥成熟帶總苞的果實(shí)，是臨床常用中藥材，多用于鼻病、過(guò)敏性疾病等的治療。蒼耳子臨床應(yīng)用歷史悠久，其毒副作用也早有記載，《品匯精要》載蒼耳子“味苦甘，性溫，有小毒”。有文獻(xiàn)報(bào)道患者誤食蒼耳子后發(fā)生中毒，引起神經(jīng)毒性反應(yīng)、肝腎損害和繼發(fā)性腦水腫［1－2］。近年在蒼耳子肝毒性作用機(jī)制、動(dòng)脈平滑肌的損傷等方面都有新發(fā)現(xiàn)［3－4］，蒼耳子毒性成分測(cè)定、炮制減毒方法［5］也取得了新的進(jìn)展。本文研究了蒼耳子水提取物對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育及運(yùn)動(dòng)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及其配制

蒼耳子水提取物樣品由四川省中醫(yī)藥研究院提供，其水溶性好，復(fù)溶后過(guò)濾，儲(chǔ)液濃度為10 mg／m L，4℃保存?zhèn)溆?。脫膜劑為鏈霉蛋白酶，?gòu)自北京索萊寶公司。三卡因購(gòu)自Sigma公司，蒸餾水配制為1 mg／mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用斑馬魚為AB系斑馬魚，魚種取自山東省科學(xué)院斑馬魚藥物篩選平臺(tái)。斑馬魚的養(yǎng)殖和繁殖參照Westerfield法［6］。

1.3 發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)

取健康成熟的斑馬魚雌雄交配繁殖獲得受精卵，純凈水沖洗3次后，再將受精卵移入胚胎培養(yǎng)用水中，28℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)發(fā)育。取受精后12 h胚胎隨機(jī)分組，每組20只，設(shè)蒼耳子提取物4.7、6.3、8.4、11.25、15、20μg／m L共6個(gè)濃度組和空白對(duì)照組，光照培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)至48 h，計(jì)算各組孵化率；取受精后24 h胚胎隨機(jī)分組，每組20只，設(shè)蒼耳子提取物0.93、1.85、3.75、7.5、15、30μg／m L濃度組和空白對(duì)照組，光照培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)至60 h后，用三卡因1 mg／mL實(shí)施麻醉后在XSJ2D型（Olympus公司）倒置顯微鏡下統(tǒng)計(jì)心率和死亡率。

1.4 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)斑馬魚行為學(xué)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定蒼耳子提取物1.85、3.75、7.5、15、30μg／mL濃度組和空白對(duì)照組，24孔板每孔一只120 hpf胚胎，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組6個(gè)胚胎，將24孔板放入培養(yǎng)箱孵育1 h，然后將24孔板放入斑馬魚行為學(xué)分析系統(tǒng)的暗箱中，使用zeblab軟件分別采集10、20、30 min內(nèi)各組總游行距離、游行時(shí)間和轉(zhuǎn)圈值，其中游行速度由總距離／游行時(shí)間得到，各數(shù)值分別計(jì)入統(tǒng)計(jì)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)求均值，并進(jìn)行樣本組間多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 多濃度蒼耳子水提取物對(duì)斑馬魚的發(fā)育毒性

蒼耳子水提取物對(duì)12 h卵膜內(nèi)斑馬魚的發(fā)育有毒性反應(yīng)，隨著濃度增加，斑馬魚胚胎的孵化率降低，大于15μg／m L時(shí)孵化率低于40%（圖1）；發(fā)育24 h的斑馬魚胚胎死亡率隨著濃度的增加逐漸增加，在15μg／m L時(shí)，死亡率增加明顯，高濃度組出現(xiàn)心臟積液，翹尾等畸形（圖2～3）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.93μg／mL低濃度蒼耳子提取物可顯著性地提高心率，當(dāng)濃度大于7.5μg／mL時(shí)心率出現(xiàn)顯著性降低（圖4）。

2.2 多濃度蒼耳子水提取物對(duì)斑馬魚運(yùn)動(dòng)行為的影響

在30 min行為軌跡分析中，3.75μg／mL以上濃度藥物組與對(duì)照組比較隨著濃度的增加，斑馬魚胚胎游行速度明顯提高；轉(zhuǎn)圈均值也顯著增加（圖5～6），在濃度大于3.75μg／m L時(shí)尤為明顯，30μg／m L濃度組在30 min內(nèi)轉(zhuǎn)圈均值出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)（圖7）。

圖1 蒼耳子水提取物對(duì)斑馬魚胚胎孵化率的影響Fig.1 Impact of FX extract on hatch rate of zebrafish embryos

圖2 蒼耳子水提取物對(duì)斑馬魚胚胎死亡率的影響Fig.2 Impact of FX extract on mortality rate of zebrafish embryos

圖3 蒼耳子水提取物對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育影響Fig.3 Impact of FX extract on the growth of zebrafish embryos

圖4 蒼耳子水提取物對(duì)斑馬魚胚胎心率的影響Fig.4 Impact of FX extract on heart rate of zebrafish embryos

圖5 蒼耳子水提取物對(duì)斑馬魚游泳速度的影響Fig.5 Impact of FX extract on swimming speed of zebrafish embryos

圖6 蒼耳子水提取物對(duì)斑馬魚轉(zhuǎn)圈值的影響Fig.6 Impact of FX extract on rotation value of zebrafish embryos

圖7 蒼耳子水提取物對(duì)斑馬魚行為軌跡的影響Fig.7 Impact of FX extract on behavior track of zebrafish embryos

3 討論

由于中藥材多以復(fù)方應(yīng)用于臨床，使得其毒副作用在長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用中往往被忽視。近年來(lái)隨著對(duì)中藥材研究的逐步深入，關(guān)于中藥材及中成藥毒副作用的報(bào)道逐漸增多，增進(jìn)了對(duì)中藥材的毒副作用的認(rèn)識(shí)，毒性研究促使其應(yīng)用更加的安全規(guī)范，對(duì)于拓展中藥材尤其有毒中藥的應(yīng)用有深遠(yuǎn)的意義。

斑馬魚作為一種新型模式動(dòng)物，具有許多與眾不同的特點(diǎn)，例如產(chǎn)卵量多、繁殖周期快且易于飼養(yǎng)，前期胚胎整體透明［7－8］，斑馬魚的基因圖譜基本清晰且與人類相似。因此，斑馬魚在行為學(xué)中的應(yīng)用前景逐漸被研究者所認(rèn)識(shí)［9－11］。行為學(xué)檢測(cè)是一種比較經(jīng)濟(jì)、便捷和有效的方法，在相應(yīng)軟件的幫助下，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)不僅變得簡(jiǎn)單快捷，而且可以定量或是高通量地研究成癮性、學(xué)習(xí)、失眠以及焦慮抑郁等行為學(xué)改變。

有報(bào)道指出蒼耳子中的蒼術(shù)苷（atractyloside）與羧基蒼術(shù)苷（carboxyatractyloside）是主要的毒性成分，也是活性成分，已發(fā)現(xiàn)其包括急性與亞急性毒性、肝腎損害、細(xì)胞毒性等毒性反應(yīng)［12－13］，但對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究了蒼耳子提取物對(duì)斑馬魚的毒性作用，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加和斑馬魚胚胎出現(xiàn)孵化率降低、死亡率增加、心臟畸形等毒性體征，提示蒼耳子對(duì)于斑馬魚發(fā)育及循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育有明顯毒性。在行為學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，蒼耳子提取物具有興奮作用，隨著濃度增加，游行速度、轉(zhuǎn)圈值均明顯增加；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，速度出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但仍高于對(duì)照組。提示蒼耳子提取物對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有一定興奮作用，這種作用是單純神經(jīng)毒性或者是整體毒性的反應(yīng)還需要更深入的實(shí)驗(yàn)研究。斑馬魚行為分析可以減為中藥神經(jīng)系統(tǒng)毒性研究的快捷研究手段，有利于中藥新毒性的發(fā)現(xiàn)，對(duì)于全面地了解有毒中藥的副作用大有益處。

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Toxicity of Fructus Xanthii extract to the growth and motion behavior of zebrafish embryos

CHEN Xi-qiang，HOU Hai-rong，LIU Ke-chun*，WANG Xi-min，PENG Wei-bing，HAN Li-wen，WANG Xue，CHEN Wei-yun
（Shandong Provincial Key Labo ratory of Biosensors，Biology Institu te，Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014，China）

We put 12／24h zeb rafish emb ryos after fertilization into the solution of different concentrations Fruc tus Xanthii（FX）to investigate the toxicity of FX extract to the grow th andmotion behavior of zebrafish embryos．We then calculate their hatch rate，mortality rate，and heart rate under a mic roscope after different time．We treat120 h zeb rafish embry of or 60 minutes with different concentrations FX extrac t，and then recordtheir behavior track within 0～10 m，10～20 m，and 20～30 mw ith ethology analysis system．We also get sw imming speedbasedon their sw imming distance andtime andtheir rotation value．Results show that FX extrac t has toxicity to 12 h zeb rafish emb ryos after fertilization，which decrease their hatch rate．The hatch rate is below 40%when the extrac t concentration is greater than 15μg／mL．FX extract of 0．93μg／mL can inc rease the heart rate of 24 h zeb rafish emb ryos（P≤0．01）．We discover that sw imming speedandrotation value all significantly increase when the extract concentration is greater than 3μg／mL through ethology analysis．Our conclusion is that FX extrac thas toxicity to zeb rafish embryos and can inc rease their heart rate ands wimming speed．

R965.1；R932；R944

A

1002-4026（2014）05-0009-05

10.3976／j.issn.1002－4026.2014.05.002

2014-06-20

國(guó)家自然科學(xué)基金（81202584）；山東省科技攻關(guān)項(xiàng)目（2011GHY11505）

陳錫強(qiáng)（1972－），男，博士，研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)。Email：cxqq＠sina.com

*通訊作者，劉可春，男，博士，研究方向?yàn)樗幬锖Y選。Email：hliukch＠sdas.org