褚 玥 梁德沛 孫遠(yuǎn)明,3 柳春紅,3 劉 輝

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，廣州 510642)(廣東省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院順德基地2，佛山 528300)(廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室3，廣州 510642)

劉輝，男，1980年出生，博士，食品科學(xué)與工程

鄰苯二甲酸酯(Phthalate acid esters，PAEs)是塑料工業(yè)中普遍使用的一類化學(xué)物質(zhì)，主要用作增塑劑和軟化劑，可增大塑料的可塑性和韌性，提高塑料的強度。PAEs的某些種類還可用作農(nóng)藥載體、驅(qū)蟲劑、化妝品、潤滑劑和去污劑的生產(chǎn)原料。據(jù)統(tǒng)計2009年世界增塑劑產(chǎn)能約910萬t，產(chǎn)量約710萬t，其中PAEs增塑劑約占總產(chǎn)量的88%，近年來，由于塑料制品的廣泛使用，該類化合物的產(chǎn)量也在逐年增加[1]。大量塑料制品廢棄后其中所包含的PAEs必將被釋放到周邊環(huán)境，已有報道多個城市飲用水受到不同程度PAEs污染，主要來源于環(huán)境中廢棄塑料制品PAEs的釋放[2-3]。PAEs與塑料之間通過氫鍵和范德華力相聯(lián)結(jié)，彼此保持獨立的化學(xué)性質(zhì)，由于結(jié)合不緊密，所以容易從塑料中揮發(fā)遷移至環(huán)境中。有研究報道，蔬菜對土壤中PAEs具有較強的吸收累積能力，不同蔬菜類型、不同地點、不同PAEs污染類型下蔬菜的累積量不同[4-5]，此外，PAEs與食品直接接觸時，易遷移到食品中，污染食品[6]。目前，在大氣、水體、土壤、生物乃至人體等自然和人類環(huán)境中普遍發(fā)現(xiàn)PAEs的存在，在全球主要工業(yè)國家環(huán)境中均已達(dá)到普遍檢出的程度，已成為全球性最普遍的一類有機污染物，被稱為第2個全球性“PCB污染物”[7]。中國國家環(huán)?？偩趾兔绹h(huán)保署(EPA)已將鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯等6種PAEs列為優(yōu)先控制的有毒污染物。REACH法規(guī)亦將鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯、鄰苯二甲酸丁芐酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯列為高關(guān)注物質(zhì)[8]。PAEs是脂溶性物質(zhì)，一旦進入人體，便很快積蓄在脂肪組織里，不易排泄出去，富集人體內(nèi)，從而導(dǎo)致人體內(nèi)殘留著高濃度的鄰苯二甲酸酯[9]。研究表明，PAEs具有一定的急性毒性，生殖毒性，在體內(nèi)長期累積有致癌、致突變等毒性，并具有一定的內(nèi)雌激素活性[10-14]。

目前，PAEs的測定方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法，大多數(shù)針對塑料制品、電子電器產(chǎn)品或環(huán)境樣品、土壤栽培農(nóng)作物中污染程度的測定，也有針對食品中PAEs遷移量檢測的報道[15]。但是大多研究都只針對單一種類的食品，針對不同種類的食品中PAEs的檢測，特別是對機制復(fù)雜、高油脂食品中PAEs的研究略有不足。本試驗對不同類型的食品分別進行了研究，比較了不同萃取溶劑和萃取方法的檢測結(jié)果，優(yōu)化了樣品分離、凈化方法及測定條件，建立了同時測定16種PAEs的GC-MS方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

GCMS-QP2010Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司；DM-5MS彈性石英毛細(xì)管(60 m×0.25 mm×0.25μm)色譜柱：美國J&W Scient if ic公司；GPC凝膠色譜儀：美國J2 scientific公司；N-1001DWA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：東京理化(上海)公司； PSA固相萃取小柱：DIKMA公司。16種鄰苯二甲酸酯(PAEs)：Dr.Erenstorfer,Gremany公司；正己烷、乙酸乙酯、環(huán)己烷、二氯甲烷、乙腈(均為色譜純)：TEDIA公司；氯化鈉(AR)、無水硫酸鈉(AR)、Florisil硅藻土(AR)等其余試劑：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

單標(biāo)儲備液：配制16類PAEs實驗所用的單標(biāo)儲備液的質(zhì)量濃度為4 000 mg/L，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩；旌蠘?biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備：取一定量的4 000 mg/L的PAEs的單標(biāo)儲備液，用正己烷配成5.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液, 4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量用正己烷分別稀釋成質(zhì)量濃度為20、100、500、1 000、2 000、5 000 μg/L的PAEs的標(biāo)準(zhǔn)列，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品前處理

1.3.1 不含油的水性樣品

此類樣品包括飲用水、果汁、功能飲料、可樂等飲料。準(zhǔn)確移取樣品5 mL，加至10 mL玻璃離心管中，準(zhǔn)確加入正己烷2.0 mL，充分旋渦混合，20 ℃水浴超聲萃取20 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液進行GC-MS分析。

1.3.2 不含油的固體樣品

稱取5 g樣品于50 mL具塞玻璃管中，加入25 mL的正己烷，漩渦混合1 min，20 ℃水浴超聲萃取30 min。取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，正己烷定容至2 mL，上機GC-MS檢測。

1.3.3 GPC凝膠滲透色譜柱

柱分離度：玉米油與鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯的分離度>85%；流動相：乙酸乙酯：環(huán)己烷(1∶1)；流速：4.5 mL/min； 流出液收集時間：18～34 min。

1.3.4 乳制品

稱取2 mL樣品于10 mL玻璃離心管中，加入4 mL的正己烷，1 g氯化鈉，充分漩渦混合， 20 ℃水浴超聲萃取20 min，3 000 r/min離心，10 min，取上清液，氮吹濃縮至干，用乙酸乙酯：環(huán)己烷(體積比1∶1)定容至10 mL，漩渦混合2 min，經(jīng)GPC凝膠滲透色譜裝置凈化，收集流出液(參考條件見1.3.3)，經(jīng)氮吹干，正己烷定容至2 mL，進行GC-MS分析。

1.3.5 食用油

稱取0.5 g(精確至0.1 mg)油脂類樣品，加入50 mL具塞玻璃管中，加入正己烷25 mL，漩渦混合1 min， 20 ℃水浴超聲萃取30 min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用乙酸乙酯：環(huán)己烷(體積比1∶1)定容至10 mL，漩渦混合2 min，經(jīng)GPC凝膠滲透色譜裝置凈化，收集流出液(參見1.3.3)，經(jīng)氮吹干，正己烷定容至2 mL，進行GC-MS分析。

1.3.6 油脂類固體

稱取0.5 g(精確至0.1 mg)油脂類樣品，加入50 mL具塞玻璃管中，首先用25 mL正己烷提取1次，漩渦混合1 min，20 ℃水浴超聲萃取30 min，靜置分層，取上清液于茄型瓶中，再用25 mL正己烷二次提取，收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用乙酸乙酯：環(huán)己烷(體積比1∶1)定容至10 mL，漩渦混合2 min，經(jīng)GPC凝膠滲透色譜裝置凈化，收集流出液(參見1.3.3)，經(jīng)氮吹干，正己烷定容至2 mL，進行GC-MS分析。

1.4 GC-MS分析條件

樣品采用選擇離子檢測模式(SIM)，分組檢測見表1所示。

表1 SIM模式下PAEs質(zhì)譜測定的保留時間和特征離子

電子轟擊離子源(EI)，電子能量70 eV， 離子源溫度230 ℃。進樣口溫度:280 ℃，不分流進樣，進樣量1 μL，載氣為氦氣，載氣流速0.5 mL/min，碰撞氣為氬氣，柱初始溫度120 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升溫至220 ℃，保持2 min, 以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持4 min，再以以20 ℃/min升溫至310 ℃，保持10 min。接口溫度： 310 ℃，溶劑延遲：3.5 min。

為避免樣品中其他組份的干擾和提高靈敏度，采用GC-MS的選擇離子檢測(SIM)方式。在SIM模式下，檢測器只檢測選定的特征離子，在相同掃描周期內(nèi)，用以檢測每個離子的時間更長，因而比全掃描(SCAN)模式靈敏度高5～100倍，使采集的靈敏度和重現(xiàn)性達(dá)到最優(yōu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

向樣品(香腸)中加入16類PAEs的標(biāo)準(zhǔn)溶液500 μg/kg按1.3.3的步驟進行提取，比較了表2中所列溶劑的提取效果。

表2 不同提取溶劑的提取率

結(jié)果表明，提取效率：正己烷> 二氯甲烷>乙酸乙酯∶環(huán)己烷(1∶1)，其中，乙酸乙酯∶環(huán)己烷(1∶1)部分PAES如DEEP、DCHP回收率過高，溶劑帶入本底過高，而二氯甲烷毒性較大。 綜上，選用正己烷為提取溶劑。

2.1.2 萃取方法的選擇

目前，針對含油脂類固體中PAEs的萃取方法可采用液-液萃取、柱層析分離、固相萃取以及固相微萃取等。試驗向樣品(香腸)中加入16類PAES的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以正己烷作為提取溶劑，對比了PSA固相萃取法(玻璃萃取小柱500 mL/6 mL，依次加入5 mL丙酮、5 mL正己烷，棄去流出液，進行活化，油脂類樣品提取液2 mL進樣，流速控制在1 mL/min，收集流出液洗脫，再依次加入5 mL正己烷、5 mL 4%丙酮-正己烷，收集合并流出液，40 ℃氮吹至1 mL GCMS上機檢測)；弗羅里硅土玻璃層析柱法[16]；GPC法按1.3.6進行，加標(biāo)回收率如表3。

表3 不同萃取方法對16類PAEs的提取效果

結(jié)果表明，正己烷液液提取時，提取率：GPC>PSA-SPE>弗羅里硅土-SPE。其中，使用填料為PSA 的固相萃取小柱時，其去除脂肪酸和油脂的能力較好，對大部分PAES的提取效率較好，較GPC法操作方便，但是PSA-SPE對BMEP和BMPP的吸附作用過大，導(dǎo)致這2種PAES的提取效率過低。GPC法16類PAES的提取率在76.16%～115.16 %之間，萃取效果較好，且GPC去除脂肪能力較好。因而，本試驗選用GPC法對樣品進行萃取。

2.2 定性分析

根據(jù)本試驗所確定的分析條件，將16種鄰苯二甲酸酯類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣，以保留時間定性，分離效果見圖1。

由圖1可以看出，16種化合物能在22.5 min內(nèi)有效地分開，峰型尖銳，對稱性好，出峰附近都沒干擾峰，各峰間隔適宜，是理想的色譜檢測條件。

圖1 16種鄰苯二甲酸酯的總離子圖

2.3 線性關(guān)系和檢出限

在確定的色譜和質(zhì)譜分析條件下對一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進行GC-MS分析，以定量離子的峰面積對被測組分的質(zhì)量濃度進行回歸分析。以大于3倍信噪計算檢出限。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表4。由表4可知,16種鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)在20 ～5 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，16種鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)在食品中的檢出限為0.02 mg/kg。

表4 16種鄰苯二甲酸酯類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.4 回收率與精密度

在碳酸飲料、水果、油類、乳制品、肉制品等混樣中分別添加200、500、1 000 ng的鄰苯二甲酸酯，平行3次，GC-MS檢測，結(jié)果見表5。

由表5可見，當(dāng)添加鄰苯二甲酸酯類增塑劑濃度為0.40～2.00 mg/kg時，回收率為75%～115%之間，RSD為1.00%～10%，說明本方法準(zhǔn)確可靠。

表5 肉類樣品中16種鄰苯二甲酸酯類化合物的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

注：1)鄰苯二甲酸酯混合加標(biāo)量為200 ng；2)鄰苯二甲酸酯混合加標(biāo)量為500 ng；3)鄰苯二甲酸酯混合加標(biāo)量為1 000 ng。

2.5 實際樣品檢測

本試驗選用碳酸飲料、乳制品、非油脂類蔬菜水果、油脂類固體食品5類8種食品混樣作為研究對象，樣品經(jīng)正己烷溶解、超聲波輔助提取、GPC凝膠色譜法萃取濃縮富集等預(yù)處理后GC-MS分析，樣品加標(biāo)及其實際檢測的色譜圖見圖2和圖3，測定結(jié)果見表6。

表6 樣品中PAEs的檢測結(jié)果

注：ND表示未檢測到。

檢測結(jié)果表明，采集的食品樣品中均有不同程度PAEs污染，檢出的PAEs種類有DMP、DEP、DIBP、DBP和DEHP，其余11種PAEs未檢出。8種食品混樣中飲料類未檢出PAEs，酒類中DIBP檢出率最高；乳類和水果類中僅檢出DEHP含量較高；而對于肉類、油類、水產(chǎn)類和蛋類等動物性食品DIBP、DBP、DEHP的污染程度較高，這是由于鄰苯二甲酸酯是脂溶性的化合物，接觸到油脂時易于從包裝材料中溶出，轉(zhuǎn)移到食品中。在被檢出有PAEs的樣品中，幾乎都有DEHP，因為DEHP是塑料中主要的增塑劑，它的生產(chǎn)量和使用量都遠(yuǎn)高于其他的鄰苯二甲酸酯類化合物。

圖2 16種PAEs在肉類樣品加標(biāo)水平為2 mg/kg的色譜圖

圖3 肉類樣品的氣質(zhì)色譜圖

2.6 干擾的排除

試驗中應(yīng)避免使用塑料制品，試驗前對試劑、試驗用水、玻璃儀器等必須進行凈化處理，所用的玻璃器皿需要用清潔劑清洗，再水洗、丙酮浸泡2 h，然后用重蒸的正己烷清洗2次，在200 ℃焙烘2 h；并且測定試劑空白，進行比較和扣除。

3 結(jié)論

本試驗建立了氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法同時測定不同類別食品中16種鄰苯二甲酸酯的分析方法，研究了不同類別食品的分離、凈化方法，優(yōu)化了色譜分離條件，通過提取特征離子進行檢測和確證，消除了基質(zhì)干擾，避免產(chǎn)生假陽性結(jié)果，同時對不同食品中PAEs的污染狀況進行了初步評估。本方法系統(tǒng)、全面、準(zhǔn)確、可靠，定量下限達(dá)0.02 mg/kg，可應(yīng)用于各類食品中鄰苯二甲酸酯類的測定，對于食品中鄰苯二甲酸酯的污染監(jiān)控檢測具有十分重要的意義。

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