戚汝山 宋明山

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266021；2.泰安市第一人民醫(yī)院，山東 泰安 271000；3.泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院；山東 泰安 271000)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是起源于腎實(shí)質(zhì)小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，又稱腎腺癌，簡稱為腎癌，占成人惡性腫瘤的2%～3%[1]。在所有泌尿系腫瘤中占第二位。近三分之一的腎癌患者在確診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而無法接受手術(shù)根治。雖然手術(shù)切除可治愈大部分的早期患者, 但手術(shù)后的復(fù)發(fā)率仍高達(dá)20%～40%[2], 腎癌容易發(fā)生轉(zhuǎn)移的部位是淋巴結(jié)、肺、骨、腦等器官。轉(zhuǎn)移性腎癌的預(yù)后相當(dāng)差, 中位生存期6～12個(gè)月, 5年生存率小于10%。因此轉(zhuǎn)移性腎癌的治療仍是臨床上面臨的一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。基質(zhì)金屬蛋白酶是高度保守的依賴于鋅離子的內(nèi)切蛋白水解酶家族, 可降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的大多數(shù)蛋白質(zhì)，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用。MMP-9屬Ⅳ型膠原酶，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的主要成分，破壞局部組織結(jié)構(gòu)和基底膜屏障，促進(jìn)腫瘤新生血管形成等，在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中都有MMPs活性的顯著增加。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測了含有腎癌組織及正常腎組織的病理切片中MMP-9蛋白的表達(dá),分析了MMP-9表達(dá)水平與患者年齡、病理分期、分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、隨訪記錄等臨床參數(shù)間的關(guān)系，探討了MMP-9與腎癌患者臨床預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取泰安市第一人民醫(yī)院泌尿外科2002年1月至2014年1月間臨床腎癌根治性切除術(shù)腎癌組織150例，癌旁組織30例，正常腎組織20例，并選取典型癌組織區(qū)域，癌旁區(qū)域(>2 cm)及正常腎組織制成蠟塊?；颊吣挲g26～79歲，中位年齡51.2歲。男性 例，女性 例。患者的分期根據(jù)UICC 2009 TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，分級根據(jù)Fuhrman分級系統(tǒng)。TNMⅠ期：40例，Ⅱ期：64例，Ⅲ：38例，Ⅳ例：18例。Fuhrman分級，1級：35例，2級：74例，3～4級：41例。入選的患者均符合以下標(biāo)準(zhǔn):具有完整的病例和隨訪信息,術(shù)前均未行手術(shù)治療及放、化療及內(nèi)分泌治療,入選的150例臨床腎癌患者均行腎癌根治性切除術(shù)。

1.2方法

1.2.1MMP-9測定 免疫組織化學(xué)染色(鏈霉素-過氧化物酶法，SP法)，試劑盒購自北京中山生物科技公司，按說明書進(jìn)行操作。

1.2.2結(jié)果判定 組織芯片免疫組化染色的結(jié)果由我院兩名病理科的醫(yī)師在顯微鏡下獨(dú)立完成,規(guī)定呈現(xiàn)棕黃色染色的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)不同高倍視野(×200倍)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)不少于50個(gè)細(xì)胞,計(jì)算出MMP-9陽性的平均細(xì)胞數(shù)。腎癌組織每個(gè)視野的MMP-9染色強(qiáng)度規(guī)定如下：10%～50%的腫瘤細(xì)胞染色為弱陽性,>50%的腫瘤細(xì)胞染色視為強(qiáng)陽性。采用PBS緩沖液代替第一抗體的空白對照作為陰性對照。

1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,雙邊檢驗(yàn)P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分級、分期與MMP-9之間的表達(dá)水平，各組間樣本率的差異的比較采用χ2(chi-square,卡方)檢驗(yàn)。Kaplan-Meier方法計(jì)算MMP-9表達(dá)與患者無復(fù)發(fā)生存率的生存曲線，用log-rank計(jì)算兩者生存曲線的區(qū)別有無意義。

2 結(jié) 果

2.1MMP-9蛋白在腎癌組織中的表達(dá)及與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系

免疫組化染色的方法檢測了含有腎癌組織及正常腎組織的病理切片中MMP-9蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示腎癌細(xì)胞染色主要位于細(xì)胞質(zhì),并且伴有少量胞核染色，腎癌組染色呈強(qiáng)陽性，而癌旁神組織及正常腎組織染色呈弱陽性(圖1)，而且經(jīng)比較后其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。我們隨后分析了 MMP-9表達(dá)水平與患者年齡、病理分期、分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)間都有密切關(guān)系性。結(jié)果表明腎癌患者中MMP-9表達(dá)與腫瘤的病理分期、分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P=0.009；P=0.017；P=0.004)，但是MMP-9跟年齡和腫瘤大小無明顯關(guān)系(P=0.412；P=0.083)。

2.2MMP-9表達(dá)及臨床病理指標(biāo)與患者預(yù)后的關(guān)系

通過隨訪150例患者，從5個(gè)月到80個(gè)月(中位時(shí)間：35.2)，對這些患者進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析并繪制了生存曲線。通過Kaplan-Meier方法計(jì)算了MMP-9及臨床病理指標(biāo)與患者預(yù)后的關(guān)系。從結(jié)果可知，MMP-9表達(dá)、腫瘤分級、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者的無復(fù)發(fā)生存率有相關(guān)性(P<0.001；P<0.001；P=0.012；P<0.001)，而年齡和腫瘤大小與無復(fù)發(fā)生存率無明顯關(guān)系(P=0.596；P=0.063)。我們還通過繪制生存曲線來闡述MMP-9的表達(dá)與患者生存率之間的關(guān)系(圖2)。結(jié)果顯示，有MMP-9高表達(dá)的患者的生存率明顯低于MMP-9低表達(dá)的患者(P<0.001)。

圖1 MMP-9的免疫組化結(jié)果

圖2.Kaplan-Meier生存曲線

MMP-9高表達(dá)與低表達(dá)的腎癌患者的無復(fù)發(fā)生存率的生存曲線，MMP-9高表達(dá)的患者的生存率明顯低于MMP-9低表達(dá)的患者，并且兩者的差異有意義(P<0.001)。

3 討 論

腎細(xì)胞癌發(fā)病年齡可見于各年齡段，高發(fā)年齡50～70歲[3]，腎癌的病因未明。其發(fā)病與遺傳、吸煙、肥胖、高血壓及抗高血壓治療等有關(guān)，遺傳性腎癌或家族性腎癌占腎癌總數(shù)的2%～4%[4]。影響腎癌預(yù)后的最主要因素是病理分期，此外，組織學(xué)分級、患者的行為狀態(tài)評分、癥狀、腫瘤中是否有組織壞死、一些生化指標(biāo)的異常和變化等因素也與腎癌的預(yù)后有關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶在惡性腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中的作用：①降解細(xì)胞外基質(zhì)；②促進(jìn)新生血管形成；③調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附；④激活具有潛在活性的蛋白質(zhì)。基質(zhì)金屬蛋白酶在癌癥病理生理過程中的作用于腫瘤的發(fā)病、轉(zhuǎn)移、血管生成等3個(gè)階段,導(dǎo)致癌細(xì)胞增長及擴(kuò)散[5]?；|(zhì)金屬蛋白酶與多種不同組織來源腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān), 其中IV型膠原酶(明膠酶A /MMP- 2, 明膠酶B /MMP - 9) 因參與細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的主要成分IV 型膠原的降解而與腫瘤的關(guān)系更為密切。腎細(xì)胞癌組織MMP-9、TIMP-1的量和血漿中MMP-9濃度均明顯高于正常人[6,9]。 史子敏等報(bào)道應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)檢測腎癌組織及正常腎組織MMP-9mRNA水平的表達(dá)情況，表明MMP-9在腎癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中起非常重要的作用[7]。王醫(yī)術(shù)等報(bào)道應(yīng)用免疫組化方法檢測32例腎細(xì)胞癌組織中MMP-9、MMP-11、第八因子相關(guān)抗原、a-平滑肌動(dòng)蛋白和增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)，表明，MMP-9、MMP-11在腎細(xì)胞癌增殖活性和血管生成方面均有重要作用[8]。

我們的研究發(fā)現(xiàn), 腎癌患者的組織樣本中MMP-9蛋白表達(dá)顯著高于正常腎組織(P=0.031)。而腫瘤的分期、分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與MMP- 9水平存在顯著相關(guān)(表1)，MMP-9表達(dá)水平也與腎癌患者的無復(fù)發(fā)生存率有明顯相關(guān)，MMP-9強(qiáng)陽性表達(dá)的患者生存率明顯低于MMP-9弱陽性表達(dá)者(P=0.037)。綜上所述，MMP-9表達(dá)與腎癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用，并且與惡性程度有關(guān)，我們初步推斷MMP-9可作為反映腎癌癌生物學(xué)行為的指標(biāo), 臨床上結(jié)合分析MMP-9在腎癌組織中的表達(dá), 有助于判斷腎癌的病理學(xué)分級, 并有助于進(jìn)一步評估預(yù)后及指導(dǎo)臨床治療。雖然目前研究的癌基因很多,但應(yīng)用于臨床中的很少,MMP-9是其中的一個(gè)。因此對患者手術(shù)前后的MMP-9水平進(jìn)行檢測, 能夠?qū)δI癌患者的發(fā)展和預(yù)后進(jìn)行早期干預(yù), 提高生存率。對MMP-9結(jié)構(gòu)和功能, 惡性腫瘤組織、細(xì)胞外基質(zhì)、甚至血漿中的基因表達(dá)及與抑制劑(TIMPs)的關(guān)系等方面進(jìn)行更深入的研究,有助于對惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移性病變機(jī)理的認(rèn)識, 最終為惡性腫瘤的診斷、治療、預(yù)后的評價(jià)提供有益幫助。

[1] 顧方六.腎腫瘤[M].濟(jì)南:山東科學(xué)技術(shù)出社,2004.889-917.

[2] Janzen N K, Kin H L, Fig l in R A, et al.Surveillance after radical orpartial nephrectomy for localized renal cell carcinoma and management of recurrent disease[J].Urol Clin North Am，2003, 30: 843.

[3] Ljungberg B, Hanbury DC, Kuczyk MA, et al.Guidelines on Renal Cell Carcinoma[J].European Association of Urology, 2008,10： 1-26.

[4] 張思維, 陳萬青, 孔靈芝, 等.中國部分市縣1998-2002年惡性腫瘤的發(fā)病與死亡[J].中國腫瘤，2006，15:430-448.

[5] 許景，劉偉國，楊小鋒，等.MMP-2、MMP-9、MMP-1在星行細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2002,19(3)：245.

[6] Kallakury BV, Karikehalli S, Haholu A, et al.Increased expression of matrix metalloproteinases 2 and 9 and tissue inhibitors of metalloproteinases 1 and 2 correlate with poor prognostic variables in renal cell carcinoma[J].Clin Cancer Res, 2001, 7(10 ): 3113.

[7] 史子敏，洪正東.EphB4與MMP-9在腎癌中的表達(dá)及意義[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009,30(6)：791.

[8] 王醫(yī)術(shù)，倪慧杰，董曉明，等.腎癌中MMP-9、MMP-11與細(xì)胞增殖活性和血管生成的關(guān)系[J]中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2009，13(5)：646.

[9] LeinM, Jung K, Laube C, Hubner T, et a.l Matrix- metalloproteinases and their inhibitors in plasm a and tumor tissue of patients with renal cell carcinoma[J].Int J Cancer, 2000, 85(6 ) : 801.