黃明亮，黃志剛，徐穎瑩，劉 清，唐 蛟，李合松

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物激素與生長(zhǎng)發(fā)育湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物。小麥籽粒中蛋白質(zhì)的含量和質(zhì)量是影響小麥品質(zhì)的關(guān)鍵因素，直接關(guān)系到面團(tuán)的特性和面包加工品質(zhì)［1］。小麥籽粒蛋白質(zhì)主要由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和麥谷蛋白組成，其中后兩種蛋白合稱為貯藏蛋白，是面筋的主要成分，約占籽粒蛋白質(zhì)的85%［2-4］。

根據(jù)分子量的大小，麥谷蛋白可分為高分子量麥谷蛋白亞基 (HMW-GS)和低分子量麥谷蛋白亞基 (LMW-GS)，其中HMW-GS約占小麥籽粒蛋白質(zhì)總量的12%，其組成和質(zhì)量直接影響小麥面粉的品質(zhì)［5］。

HMW-GS中以5和10亞基對(duì)面粉的品質(zhì)影響最大［6］，其兩者的編碼基因Dx5和Dy10共同存在及連鎖表達(dá)對(duì)提高生面彈性和面包的烘烤質(zhì)量尤為明顯［7］，但傳統(tǒng)的雜交育種手段難以同時(shí)獲得Dx5與Dy10重組基因且穩(wěn)定表達(dá)的小麥后代。然而采用遺傳轉(zhuǎn)化分子育種手段獲得Dx5與Dy10基因表達(dá)的新型小麥種質(zhì)資源已有成功的先例，如Altpeter等［8］將小麥HMW-GS的Dx5和Dy10基因轉(zhuǎn)化燕麥，獲得了總蛋白質(zhì)含量、麥谷蛋白含量和聚合狀麥谷蛋白含量顯著增加的轉(zhuǎn)基因材料。

濟(jì)麥20是山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所培育的面包面條兼用型優(yōu)質(zhì)小麥品種［9］，其籽粒蛋白質(zhì)含量高，經(jīng)農(nóng)業(yè)部谷物品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心測(cè)定為17.02%(干基)。濟(jì)麥20的HMW-GS為1、7+8和5+10優(yōu)質(zhì)亞基組合［10］，其中5+10亞基由 Glu-D1位點(diǎn)的Dx5和Dy10所編碼［11］。本研究以優(yōu)質(zhì)小麥品種濟(jì)麥20為材料，克隆HWM-GS基因Dx5，并對(duì)其序列及編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在為進(jìn)一步采用遺傳轉(zhuǎn)化分子育種手段來(lái)獲得Dx5和Dy10基因高表達(dá)的新型小麥種質(zhì)資源和深入研究HMW-GS基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)理及開(kāi)展作物蛋白質(zhì)品質(zhì)的改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用濟(jì)麥20的種子由河南大學(xué)尚富德教授提供。種子經(jīng)催芽后置于人工氣候箱中，25℃恒溫培養(yǎng)15 d后用于提取基因組DNA。大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。DNA Marker、Taq DNA聚合酶、dNTP、凝膠回收試劑盒和pMD19-T載體試劑盒等購(gòu)自TaKaRa公司。引物委托北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組 DNA提取及 PCR擴(kuò)增 采用CTAB法進(jìn)行基因組 DNA提?。?2］。PCR擴(kuò)增引物為P1F:TATCATCACCCACAACACC和P1R:GCATGCCTAAGCACCAT;PCR反應(yīng)體系:50 μL體系中包括1.25 U 的 Taq DNA 聚合酶，0.2 mmol·L-1的dNTP，引物各 50 μmol·L-1，模板 DNA 200 ～ 300 ng;PCR條件:94℃預(yù)變性5 min，然后以94℃變性30 s，50℃退火30 s和72℃延伸3 min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后以72℃延伸5 min結(jié)束;擴(kuò)增產(chǎn)物于0.8%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的TA克隆與序列測(cè)定 PCR產(chǎn)物的凝膠回收按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。連接反應(yīng)按pMD19-T載體試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，利用熱激法將連接后的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌經(jīng)氨芐青霉素、X-Gal和IPTG平板篩選，挑取白色菌斑進(jìn)行菌體PCR擴(kuò)增鑒定，選取PCR呈陽(yáng)性的單菌落測(cè)序。測(cè)序工作由北京六合華大基因科技股份有限公司武漢分公司完成。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 開(kāi)放閱讀框的預(yù)測(cè)采用ORF Finder;數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索在GenBank中進(jìn)行;采用Blast程序進(jìn)行相似性分析;序列的基本分析采用DNAStar 7.1程序包進(jìn)行;進(jìn)化樹(shù)分析采用 MEGA 5.10;進(jìn)化樹(shù)的查看采用Treeview 32。

2 結(jié)果

2.1 Dx5 基因的克隆

圖1 Dx5基因的克隆Fig.1 Cloning of Dx5 gene

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，得到一條長(zhǎng)約2600 bp的DNA片段 (圖1)，該片段長(zhǎng)度與預(yù)期相符。回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與pMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取經(jīng)菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的單菌落送給華大基因公司測(cè)序。

圖2 JMDx5基因序列及其編碼的氨基酸序列Fig.2 The sequences and amino acid sequences of JMDx5 gene

2.2 測(cè)序結(jié)果與分析

測(cè)序結(jié)果經(jīng)拼接后得到長(zhǎng)度為2619 bp的序列。利用在線預(yù)測(cè)工具ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該序列的最大開(kāi)放閱讀框是+3框，長(zhǎng)度為2520 bp(從63 bp到2582 bp)，共編碼839個(gè)氨基酸殘基 (圖2)。Blast分析結(jié)果顯示，按照+3框翻譯的氨基酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中才能找到相似性高且完整的氨基酸序列，與Triticum aestivum x Secale cereale高分子量麥谷蛋白亞基(Sequence ID:gb|AGS18765.1|)的一致性 (Identities)達(dá)到99%(835/839)，且具有高分子量麥谷蛋白亞基結(jié)構(gòu)域 (圖3)，表明克隆獲得的序列為Dx5基因，將其命名為JMDx5。

2.3 JMDx5的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用BlastP對(duì)JMDx5序列進(jìn)行蛋白質(zhì)同源性搜索，去除序列的冗余，篩選JMDx5的同源蛋白質(zhì)并下載，利用MEGA 5.10軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。采用Neighbor-Joining(NJ)方法構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù) (圖4)表明，Dx5蛋白質(zhì)通過(guò)進(jìn)化可能分為兩大支，JMDx5在進(jìn)化上具有保守性;JMDx5與斯卑爾脫小麥 (Triticum spelta)、普通小麥(Triticum aestivum)及普通小麥與黑麥的雜交后代 (Triticum aestivum x Secale cereale)的Dx5進(jìn)化距離近，與長(zhǎng)穗偃麥草 (Lophopyrum elongatum)和山羊草(Aegilops sharonensis)等的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。

2.4 JMDx5二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析

登錄網(wǎng)址 (https://www.predictprotein.org/)，將JMDx5蛋白質(zhì)序列輸入，對(duì)其進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。由圖5分析可知JMDx5二級(jí)結(jié)構(gòu)可能呈單一環(huán)狀，沒(méi)有螺旋和折疊結(jié)構(gòu)，而且暴露在外和埋藏在內(nèi)的氨基酸殘基數(shù)目比較接近。

圖3 JMDx5蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 The conserved domains of JMDx5 protein

圖4 JMDx5蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 The phylogenetic of JMDx5 protein

圖5 JMDx5蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.5 JMDx5 protein secondary structure prediction chart

2.5 JMDx5蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

利用在線軟件 ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)JMDx5蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，氨基酸分子式為C3833H5794N1190O1294S7，分子量為 8.93576 KD，等電點(diǎn) pI為 6.10。穩(wěn)定系數(shù)計(jì)算結(jié)果為85.02，為不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。

3 討論

HMW-GS的組成和質(zhì)量是影響小麥面粉品質(zhì)的重要因子。HMW-GS中以5和10亞基對(duì)面粉的品質(zhì)影響最大［6］，其中5亞基由1D染色體上 Glu-D1位點(diǎn)的Dx5基因所編碼，其編碼區(qū)無(wú)內(nèi)含子，3'端有PolyA信號(hào)［13］。本研究采用蛋白質(zhì)含量高的優(yōu)質(zhì)小麥品種濟(jì)麥20，基于Blast檢索和生物信息學(xué)分析，設(shè)計(jì)特異引物，直接以基因組DNA為模板，克隆獲得了長(zhǎng)度為2619 bp的序列，該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的Dx5蛋白質(zhì)一致性達(dá)到99%，且具有HMW-GS結(jié)構(gòu)域，將其命名為 JMDx5基因并提交GenBank數(shù)據(jù)，登錄號(hào)為KJ144185。來(lái)源于優(yōu)質(zhì)小麥品種濟(jì)麥20的JMDx5基因序列與已報(bào)道的Dx5基因的序列差異很小，因此，可以作為目的基因，通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法探索其在改良作物蛋白質(zhì)品質(zhì)的用途。

生物信息學(xué)分析表明，JMDx5基因編碼含839個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈，分子量約為8.94 KD，等電點(diǎn)pI為6.10;JMDx5二級(jí)結(jié)構(gòu)可能呈單一環(huán)狀，沒(méi)有螺旋和折疊結(jié)構(gòu)，推測(cè)與其作為貯藏蛋白的功能有關(guān);系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，除去小麥屬植物，JMDx5與節(jié)節(jié)麥(Aegilops tauschii)的Dx5進(jìn)化距離較近，這為探究濟(jì)麥20品種與其它物種的進(jìn)化關(guān)系提供了依據(jù)。JMDx5基因的成功克隆及生物信息學(xué)分析，為JMDx5基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理及其與小麥蛋白質(zhì)品質(zhì)關(guān)系的研究打下了基礎(chǔ)。

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