琚姝+洪勇+黃臻輝

摘 要 丹參酮ⅡA磺酸鈉（STS）原料水溶液經(jīng)加熱降解，采用制備高效液相色譜法對(duì)其有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分離純化，獲得兩個(gè)HPLC純度大于95%的組分A （99.0 mg）和B（95.0 mg）。經(jīng)MS和NMR結(jié)構(gòu)解析，確證為1-羥基丹參酮ⅡA磺酸鈉和1，2-脫氫丹參酮ⅡA磺酸鈉。本工作為STS原料和制劑的質(zhì)量控制和穩(wěn)定性研究提供有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品，以保證其質(zhì)量可控。

關(guān)鍵詞 丹參酮ⅡA磺酸鈉 分離純化 結(jié)構(gòu)鑒定

中圖分類號(hào)：R284.1； TQ460.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2014）11-0054-04

Isolation and structure characterization of the

degradated products of sodium tanshinoneⅡA sulfonate*

JU Shu**， HONG Yong， Huang Zhenhui***

（Shanghai No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co. LTD.， Shanghai 200240， China）

ABSTRACT Two related substance A （99.0 mg） and B （95.0 mg） with HPLC purity over 95% were collected by heat degradation of the solution of sodium tanshinoneⅡA sulfonate （STS） followed by isolation and purification with the reversed phase preparative high performance liquid chromatography （Pre-HPLC）. They were finally identified as sodium 1-hydroxyltanshinoneⅡA sulfonate and sodium 1，2-dehydrotanshinoneⅡA sulfonate by analysis of MS and NMR. These two related substances verified can be used as references for the quality control and stability study of STS materials and preparations..

KEY WORDS sodium tanshinoneⅡA sulfonate； isolation； structure characterization

丹參酮ⅡA磺酸鈉（sodium tanshinoneⅡA sulfo-nate， STS），為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhza）中分離的脂溶性二萜醌類化合物丹參酮ⅡA經(jīng)磺化而得到的水溶性磺酸鹽。由于其具有抗氧化活性，抗缺氧，減少血栓形成[1]，能夠降低缺血再灌注所產(chǎn)生的心肌線粒體脂質(zhì)體過氧化物的含量、改善心肌線粒體膜的流動(dòng)性、促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立、改善心臟代謝及有效增加冠狀動(dòng)脈流量，對(duì)冠心病心絞痛及胸悶等有顯著療效[2-6]；還具有抗菌消炎、治療肝病、腎病等方面的作用[7-8]；其注射劑已在臨床上廣泛使用?，F(xiàn)代藥學(xué)研究表明，丹參中化學(xué)成分復(fù)雜，主要為水溶性丹參酚酸類和脂溶性二萜醌類丹參酮類化合物。丹參酮類化合物主要含有丹參酮Ⅰ、ⅡA、ⅡB、異丹參酮Ⅰ、ⅡA、隱丹參酮、異隱丹參酮、甲基丹參酮、羥基丹參酮等[9]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜且相近，化學(xué)全合成難度大，常規(guī)的分離純化技術(shù)難以得到單一的組分，但隨著制備液相分離技術(shù)的發(fā)展，使獲得單體組分成為可能。

丁小軍[10]采用反相和凝膠色譜法分離純化STS原料粗品，得到了10 mg 1，2-脫氫丹參酮IIA磺酸鈉；Zou等[11]采用重結(jié)晶和制備色譜純化STS原料，得到了1，2-脫氫丹參酮IIA磺酸鈉和紫丹參甲素磺酸鈉的混合物；Wang等[12]采用重結(jié)晶和制備色譜純化STS原料，從50 g STS原料得到15 mg 1 -羥基丹參酮IIA磺酸鈉、12 mg 1，2-脫氫丹參酮IIA磺酸鈉；秦引林[13-14]采用制備硅膠板從10支STS水針制劑中分離得到10 mg 1-羥基丹參酮IIA磺酸鈉，采用醋酸和鉻酸部分氧化STS法定向合成出1-羥基丹參酮IIA磺酸鈉200 mg。但從STS原料藥或水針制劑中提取有關(guān)物質(zhì)，由于其含量通常只有千分之幾，不易獲得。

STS原料和制劑在制備、儲(chǔ)存過程中因pH、光照、溫度和氧化等環(huán)境因素而導(dǎo)致降解，會(huì)出現(xiàn)酸性增強(qiáng)、含量降低等現(xiàn)象。隨著藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高，ICH指導(dǎo)原則要求盡可能提供大于0.1%的所有有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)，并闡述可能產(chǎn)生的機(jī)制、構(gòu)效關(guān)系和藥理、毒理數(shù)據(jù)等。因此，有必要規(guī)?；苽銼TS原料有關(guān)物質(zhì)。本研究為了反映STS藥物真實(shí)的穩(wěn)定性，綜合現(xiàn)有技術(shù)、方法，采用高溫破壞試驗(yàn)強(qiáng)制降解高純度的STS原料，運(yùn)用制備色譜分離純化其降解產(chǎn)物，推測(cè)其可能的降解途徑，以更加安全簡便的方法為產(chǎn)品工藝設(shè)計(jì)、質(zhì)量控制和穩(wěn)定性研究提供有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品，保證安全性和質(zhì)量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Varian SD-1制備液相儀及色譜柱裝填系統(tǒng)、色譜柱L&L4001（2.5 cm×25 cm）和L&L4002（5 cm×25 cm）、色譜散裝填料PLRP-S（10 ?m，10 nm，美國Varian公司）；色譜散裝填料ODS-AQ（5 ?m，12 nm，日本YMC公司）；Waters 2695/2489高效液相色譜儀（美國waters公司），Waters micromass ZQ單重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；Agilent Extend C18分析柱（4.6 mm×150 mm， 5 ?m，美國Agilent公司）；冷凍干燥機(jī)（上海東富龍科技股份有限責(zé)任公司）；400 M核磁共振波譜儀（NMR AvanceⅢ 400 MHz，瑞士Bruker公司）。

STS原料和純化水（上海第一生化藥業(yè)有限公司）；甲醇和三乙胺（TEA，色譜純，美國Tedia公司）；其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 STS原料處理

取STS 10.1 g，配制成10 g/L水溶液，取 1 L 溶液置于燒瓶中 于100 ℃ 加熱回流22 h，熱降解產(chǎn)物溶液經(jīng)三層濾紙過濾除去析出的固體沉淀，用0.45 ?m纖維素微孔濾膜進(jìn)行過濾澄清，濾液經(jīng)制備液相分離、純化。

1.3 色譜條件

1.3.1 分析型HPLC條件

流動(dòng)相：A為0.1%TEA水溶液，B為0.1%TEA甲醇溶液。以流動(dòng)相A與B按照下述體積比進(jìn)行線性梯度洗脫：0 min：90%A+10%B→5 min：80%A+20%B→10 min：65%A+35%B→25 min：50%A+50%B→30 min：90%A+10%B。柱溫25 ℃，流速為1 ml/min，檢測(cè)波長為271 nm，進(jìn)樣量20 ?l。

1.3.2 制備型HPLC純化條件

濾液加10%甲醇后上樣1 L，流速為100 ml/min，以流動(dòng)相A與B按照下述體積比進(jìn)行線性梯度洗脫：0 min：80%A+20%B→10 min：80%A+20%B→70 min：20%A+80%B，其余條件同 1.3.1。根據(jù)紫外檢測(cè)結(jié)果按峰收集樣品，對(duì)富集得到的組分A和B，用純水稀釋1倍后用相同條件再進(jìn)行純化，根據(jù)紫外檢測(cè)結(jié)果按峰收集樣品，得到組分A和B的純化液。

1.3.3 制備型HPLC精制條件

對(duì)純化得到的組分A和B純化液用純水稀釋1倍后上樣500 ml，流速為25 ml/min，以流動(dòng)相A與B按照下述體積比進(jìn)行線性梯度洗脫：0 min：80%A+20%B→10 min：80%A+20%B→50 min：40%A+60%B，其余條件同 1.3.1。根據(jù)紫外檢測(cè)結(jié)果按峰收集樣品，對(duì)收集組分沒達(dá)到目標(biāo)純度的樣品進(jìn)行再次精制純化，直至得到STS降解產(chǎn)物組分A和B的精制純品。

2 結(jié)果與討論

2.1 STS降解產(chǎn)物的HPLC分析

分析型HPLC檢測(cè)STS原料加熱前后的純度變化，起始原料STS（保留時(shí)間21.95 min）純度為96.57%，最大單雜純度為1.6% （圖1）；熱降解后STS（保留時(shí)間21.20 min）純度變?yōu)?6.93%，產(chǎn)生兩種主要的降解產(chǎn)物組分A （保留時(shí)間12.74 min）和B（保留時(shí)間18.65 min），純度分別為17.68% 和18.41% （圖2）。

1.3.3所獲純品溶液經(jīng)50 ℃減壓濃縮并凍干，得組分A 99.0 mg（無定形紅棕色粉末，HPLC純度為97.38%，保留時(shí)間12.68 min，圖3）、組分B 95.0 mg（無定形紅棕色粉末，HPLC純度為95.34%，保留時(shí)間19.08 min，圖4）。

2.2 質(zhì)譜鑒定

質(zhì)譜離子源為電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子掃描模式檢測(cè)，毛細(xì)管電壓為3.0 kV，離子源溫度為100 ℃，霧化氣溫度為350 ℃，霧化氣流量為600.0 L·h-1，碰撞電壓分別為4.0 eV（MS） 和15.0～30.0 eV（MS/MS），掃描范圍m/z 100～2 000。對(duì)STS降解產(chǎn)物組分A和B純品進(jìn)行測(cè)定。質(zhì)譜測(cè)得組分A分子離子峰[M-Na]-質(zhì)荷比（m/z）為389.33，推測(cè)其為分子式可能為C19H17O7SNa（符合其理論相對(duì)分子量為412.39）；質(zhì)譜測(cè)得組分B分子離子峰質(zhì)荷比（m/z）為371.26，推測(cè)其分子式可能為C19H15O6SNa（符合其理論相對(duì)分子量394.05）。

2.3 核磁共振鑒定

STS降解產(chǎn)物組分A和B純品各20 mg用D2O溶解后，進(jìn)行1H NMR和13C NMR分析（表1），碳編號(hào)和結(jié)構(gòu)見圖5，最終經(jīng)解析確證組分A的結(jié)構(gòu)為1-羥基丹參酮ⅡA磺酸鈉，組分B的結(jié)構(gòu)為1，2-脫氫丹參酮ⅡA磺酸鈉。

3 結(jié)論

本研究對(duì)STS原料進(jìn)行高溫強(qiáng)制降解并分離純化后獲得兩個(gè)組分A和B，其可能的降解途徑為STS氧化生成1-羥基丹參酮ⅡA磺酸鈉（組分A），隨后脫水生成1，2-脫氫丹參酮ⅡA磺酸鈉（組分B）。溫度為影響STS藥物穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，STS制備工藝中丹參酮IIA磺化反應(yīng)及可能的氧化反應(yīng)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量影響至關(guān)重要；而STS制劑采用高壓蒸汽滅菌，也可能會(huì)產(chǎn)生降解反應(yīng)。研究表明，1-羥基丹參酮ⅡA磺酸鈉和1，2-脫氫丹參酮ⅡA磺酸鈉為STS最主要的兩個(gè)降解產(chǎn)物。本文研究的方法能便捷、規(guī)?；刂苽涓呒兌鹊倪@兩個(gè)樣品，可為質(zhì)量控制提供對(duì)照品。

致謝 感謝張江藥谷公共服務(wù)平臺(tái)在MS測(cè)定中提供的幫助；感謝上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心吳節(jié)莉老師在NMR測(cè)定中提供的幫助。

參考文獻(xiàn)

[1] 李舒敏， 呂以培， 黃虹. 丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)糖尿病患者血液流變學(xué)及血脂的影響研究[J]. 臨床合理用藥， 2011， 4（10）： 8-9.

[2] 白鳳鳴. 丹參酮ⅡA磺酸鈉的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J]. 中國藥房， 2012， 23（31）： 2971-2973.

[3] 王新榮， 趙蘇. 丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)肺心病患者血流變及血脂的影響[J]. 中國生化藥物雜志， 2011， 32（3）： 237-238.

[4] 楊志霞， 林謙， 馬利. 丹參對(duì)心血管疾病藥理作用的文獻(xiàn)研究[J]. 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2012， 7（2）： 93-96， 114.

[5] 廖霓星. 丹參酮ⅡA磺酸鈉治療病毒性心肌炎的療效觀察 [J]. 現(xiàn)代診斷與治療， 2013， 24 （7）： 1550-1551.

[6] 蔡麗萍， 習(xí)志剛，楊紅.丹參酮的藥理作用和臨床研究進(jìn)展[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)， 2008， 24（3）： 321-324.

[7] 胡水秀. 丹參酮IIA磺酸鈉對(duì)肺病急性加重期血栓前狀態(tài)及肺動(dòng)脈高壓的影響[J]. 實(shí)用心腦肺血管病雜志， 2006， 14（9）： 697-698.

[8] 谷化劍， 潘耀振， 張浩. 丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)梗阻性黃疸大鼠肝、肺、腎組織丙二醛與超氧化物歧化酶的影響[J]. 醫(yī)藥前沿， 2013（23）： 105.

[9] Zhang Y， Jiang P， Ye M， et al. Tanshinones： sources， pharmacokinetics and anti-cancer activities[J]. Int J Mol Sci， 2012， 13（10）： 13621-13666.

[10] 丁小軍. 丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)照品的制備和有關(guān)物質(zhì)研究[D]. 天津： 天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 2007.

[11] Zou QG， Huang BY， He TT， et al. Identification， isolation， and characterization of impurities in sodium tanshinone Ⅱa sulfonate[J]. JLC & Rel Technol， 2009， 32（16）： 2346-2360.

[12] Wang BL， Wang H， Wang E， et al. Isolation and structure characterization of related impurities in sodium tanshinone ⅡA sulfonate by LC/ESI-MSn and NMR[J]. J Pharm Biomed Anal， 2012， 67-68： 36-41.

[13] 秦引林. 羥基丹參酮ⅡA磺酸鈉及其用途： 中國， CN 1844113A [P]. 2006-10-11.

[14] 秦引林. 去氫丹參酮ⅡA磺酸鈉及其用途： 中國， CN 102558287A [P]. 2012-07-11.

（收稿日期：2014-03-27）