王建軍,周 芳,盧 紅

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院腫瘤科,河南開(kāi)封475001)

耐甲氨蝶呤骨肉瘤細(xì)胞株耐藥關(guān)系與形態(tài)變化分析

王建軍,周 芳,盧 紅

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院腫瘤科,河南開(kāi)封475001)

目的 探索原代細(xì)胞株與耐藥細(xì)胞株在光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡下的形態(tài)學(xué)變化。方法 用逐漸遞增藥物濃度沖擊誘導(dǎo)法,逐漸建立耐藥細(xì)胞株;MTT法測(cè)定細(xì)胞株的耐藥指數(shù);用光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡觀察耐藥株與云帶細(xì)胞株形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 耐藥細(xì)胞株較原代細(xì)胞株的細(xì)胞體積增大,細(xì)胞分裂像減少,偽足突起減少;電子顯微鏡下偽足絨毛減少,細(xì)胞器有濃聚,高爾基體數(shù)量減少,細(xì)胞核染色體有核膜下濃聚。結(jié)論 耐藥細(xì)胞株細(xì)胞狀態(tài)處于受抑制狀態(tài),生命能力下降。

骨肉瘤;耐藥細(xì)胞株;形態(tài)學(xué)

骨肉瘤是青少年最常見(jiàn)的骨惡性腫瘤,其臨床特點(diǎn)在于具有很強(qiáng)的局部浸潤(rùn)能力和快速發(fā)生的遠(yuǎn)處肺轉(zhuǎn)移能力。雖然手術(shù)和化療的應(yīng)用使骨肉瘤的預(yù)后有很大的提高,復(fù)發(fā)是影響預(yù)后的重要因素。近年來(lái)研究認(rèn)為腫瘤耐藥是引起復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移因素之一[1-3]。探索腫瘤耐藥的原因,為克服耐藥尋找方法,進(jìn)一步提高患者的預(yù)后。MTX是治療骨肉瘤的重要藥物,被用在對(duì)骨肉瘤患者的新輔助化療和輔助化療中,是骨肉瘤化療的主要藥物[4]。我們通過(guò)誘導(dǎo)建立耐MTX的骨肉瘤體外模型,為進(jìn)一步研究骨肉瘤耐藥機(jī)制提供研究工具。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,通過(guò)觀察耐藥細(xì)胞與原代細(xì)胞株形態(tài)學(xué)上差別。發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞株特征表現(xiàn)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株與藥物

Saos-2細(xì)胞株(ATCC,Manassas,VA),購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所。methotrexate(MTX) MTX,上海華聯(lián)制藥,藥物用生理鹽水或50 g/L葡萄糖液稀釋成相應(yīng)濃度,分裝后-20℃保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Saos-2原代細(xì)胞的培養(yǎng) Saos-2細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、鏈霉素和青霉素各100μ/mL)于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞增殖至鋪滿培養(yǎng)皿底60～70%時(shí)傳代。

1.2.2 Saos-2細(xì)胞的藥物誘導(dǎo) 采用遞增藥物濃度沖擊誘導(dǎo)法,待細(xì)胞增殖至鋪滿培養(yǎng)皿底60～70%對(duì)數(shù)期狀態(tài)時(shí),加入起始濃度為0.05μg/m L的MTX,作用24 h后用37℃的1×PBS液洗2次,待細(xì)胞增殖至正常狀態(tài)后,重復(fù)上述藥物沖擊方法,每一種藥物濃度沖擊3次。MTX藥物遞增濃度為0.05、0.5、1、2μg/m L。耐藥誘導(dǎo)歷時(shí)6個(gè)月,不同藥物濃度點(diǎn)細(xì)胞株分別命名為Saos-2/MTX0.05、Saos-2/MTX0.5、Saos-2/MTX1、Saos-2/MTX2。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 采用MTT法檢測(cè)Saos-2、Saos-2/ MTX1、Saos-2/MTX2細(xì)胞株對(duì)MTX、IFO、DDP、ADM的敏感性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Saos-2、Saos-2/MTX1、Saos-2/MTX2細(xì)胞,用RPMI-1640培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液,分別接種到96孔板(200μL/孔,細(xì)胞數(shù)約1×104/孔)培養(yǎng)24 h,參照臨床藥物MTX血漿峰濃度(peak plasma concentration,PPC),配制成7個(gè)藥物濃度梯度實(shí)驗(yàn)孔,藥物濃度分別為:1 000 ppc、100 ppc、10 ppc、1 ppc、0.1 ppc、0.01 ppc、0.001 ppc,并每一濃度孔設(shè)3個(gè)復(fù)空,培養(yǎng)24 h后,每孔加入5%MTT 20μL培養(yǎng)4 h,棄上清液,加入二甲亞砜150μL/孔,室溫充分震蕩10 min。用Wellscan MK3型酶標(biāo)儀測(cè)每孔吸光度值,波長(zhǎng)為490 nm,并分別設(shè)無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液及接種細(xì)胞但不加藥物的細(xì)胞株做空白對(duì)照組。細(xì)胞抑制率=(1-耐藥組平均吸光度值/對(duì)照組平均吸光度值×100%),確定半數(shù)抑制濃度(IC50)。計(jì)算耐藥指數(shù)(resistance index, RI)=IC50(Saos-2/MTX1)/IC50(Saos-2)和IC50(Saos-2/MTX2)/IC50(Saos-2)。

1.2.4 細(xì)胞光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察 在倒置顯微鏡下觀察Saos-2,Saos-2/MTX1、Saos-2/MTX2細(xì)胞株光鏡下形態(tài)。

1.2.5 細(xì)胞電子顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察 另取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期的Saos-2、Saos-2/MTX1、Saos-2/MTX2細(xì)胞株,先用體積分?jǐn)?shù)3%戊二醛預(yù)固定,體積分?jǐn)?shù)1%四氧化鋨再固定,丙酮逐級(jí)脫水,Epon812包埋,醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色,透射電鏡觀察細(xì)胞核與細(xì)胞器的變化。

2 結(jié)果

2.1 Saos-2、Saos-2/MTX1、Saos-2/MTX2細(xì)胞株的藥物敏感性

MTT檢測(cè)結(jié)果表明:Saos-2、Saos-2/MTX1、 Saos-2/MTX2細(xì)胞株對(duì)MTX的IC50分別為(25.78 ±0.29)μg/m L、(125.56±0.24)μg/m L和(328.24 ±0.29)μg/m L,Saos-2/MTX1的RI是Saos-2的4.87倍,低度耐藥;Saos-2/MTX2細(xì)胞的RI是Saos-2的12.73倍,中度耐藥;并且對(duì)IFO、ADM存在低度耐藥;而對(duì)DDP無(wú)明顯耐藥性。

2.2 光鏡下細(xì)胞形態(tài)變化

倒置顯微鏡下觀察到Saos-2細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),體積中等,大小均勻,細(xì)胞有明顯偽足生長(zhǎng),胞漿較少,胞漿耐細(xì)胞顆粒明顯,細(xì)胞核較大,核仁清晰,可見(jiàn)明顯細(xì)胞分裂象,有明顯多核現(xiàn)象,可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)染色體團(tuán)塊現(xiàn)象,凋亡小圓細(xì)胞比例較少。(見(jiàn)圖1)。Saos-2/MTX 1細(xì)胞株細(xì)胞體積稍增大,有偽足突起現(xiàn)象,胞漿內(nèi)細(xì)胞顆粒明顯增多,細(xì)胞核較原代增大明顯,細(xì)胞核分裂象叫原代少見(jiàn),可常見(jiàn)細(xì)胞核內(nèi)染色體團(tuán)聚現(xiàn)象,凋亡小圓細(xì)胞比例較原代細(xì)胞增多常見(jiàn)(見(jiàn)圖2)。Saos-2/MTX2光鏡下觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞體積較Saos-2明顯增大,細(xì)胞橢圓形、多角形,偽足現(xiàn)象較原代較少,胞漿較原代致密,胞漿著色加深,細(xì)胞器密集。細(xì)胞核體積較原代減小,多核、核分裂現(xiàn)象減少,核膜不清晰,核內(nèi)染色體聚集現(xiàn)象不明顯。小圓凋亡細(xì)胞明顯增多見(jiàn)(見(jiàn)圖3)。

圖1 原代Saos-2細(xì)胞株光鏡下觀察

圖2 耐藥Saos-2/MTX1細(xì)胞株光靜下觀察

圖3 Saos-2/MTX2細(xì)胞株光鏡下觀察

2.3 電子顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)變化

電子顯微鏡下觀察到Saos-2原代細(xì)胞株,細(xì)胞膜完整,偽足、細(xì)胞絨毛豐富,胞漿內(nèi)胞漿豐富,可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)脂肪空泡,線粒體大小均勻,形態(tài)完整,可見(jiàn)明顯內(nèi)脊凸起;高爾基體數(shù)量多,有多層折疊。核膜完整,未見(jiàn)染色體濃聚現(xiàn)象,核仁明顯(見(jiàn)圖4);Saos-2/ MTX 1細(xì)胞株細(xì)胞膜完整,細(xì)胞絨毛凸起較原代減少,細(xì)胞胞漿豐富,線粒體數(shù)量在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)有增多,線粒體較原代體積減小,形態(tài)完整;高爾基體數(shù)量可見(jiàn),較原代減少。核膜完整,未見(jiàn)染色體濃聚現(xiàn)象,核仁明顯(見(jiàn)圖4);Saos-2/MTX2電鏡下觀察,細(xì)胞多形性,包膜完整,細(xì)胞絨毛進(jìn)一步減少,細(xì)胞漿較少,線粒體數(shù)量下降,胞漿內(nèi)染色體濃聚顆粒明顯,高爾基體少見(jiàn)。核膜完整,染色體未見(jiàn)濃聚核膜現(xiàn)象,核仁不明顯(見(jiàn)圖6)。

圖4 原代Saos-2細(xì)胞株電子顯微鏡下觀察(×5800倍)

圖5 原代Saos-2/MTX1細(xì)胞株電子顯微鏡下觀察(×5800倍)

圖6 原代Saos-2/MTX2細(xì)胞株電子顯微鏡下觀察(×5800倍)

3 討論

化學(xué)治療是骨肉瘤綜合治療的重要組成部分,化療方案加入治療后,治療效果有明顯提高,改善了患者預(yù)后,也提高了保肢率,提高了患者生存質(zhì)量[5]。本實(shí)驗(yàn)初步觀察耐藥細(xì)胞株在耐藥產(chǎn)生后,出現(xiàn)的細(xì)胞形態(tài)改變,耐藥細(xì)胞株兩株表現(xiàn),隨著細(xì)胞耐藥能力增強(qiáng),細(xì)胞再生能力,細(xì)胞代謝能力下降,細(xì)胞凋亡數(shù)量增多,光鏡下多核現(xiàn)象增多;電鏡下特點(diǎn)也支持這個(gè)觀點(diǎn),細(xì)胞器數(shù)量增多,高爾基體疊層減少,說(shuō)明細(xì)胞漿內(nèi)容數(shù)量減少。說(shuō)明細(xì)胞分裂時(shí)間周期長(zhǎng),分裂細(xì)胞數(shù)目整體下降。所以說(shuō)整體來(lái)說(shuō)細(xì)胞耐藥還是對(duì)新環(huán)境的不適應(yīng),細(xì)胞整體能力下降,但是隨著細(xì)胞自身適應(yīng)能力調(diào)整,有可能恢復(fù)原來(lái)的增值能力。

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[責(zé)任編輯 李武營(yíng)]

Analysis of methotrexate in osteosarcoma cell line resistance and morphological changes of resistance

WANG Jianjun，ZHOU Fang，LU Hong
（Department of Oncology，Huaihe Hospital of Henan University，Kaifeng，Henan 475001，China）

Objective To explore the primary cells and multidrug resistance cell morphological changes in the optical microscope and electron microscope.Methods Using gradually increasing drug concentration shock induced method.Gradually establish a multidrug resistance cell line resistant index determination；MTT cell line；observation of resistant strains and cloud band cell morphological changes by optical microscopy and electron microscopy.Results The drug resistant cell line than the primary cultured cell lines increased cell volume，cell division like pseudopodium projection reduction；electron microscope pseudopodia fluff reducing，organelles are concentrated，the Golgi complex decreased，the chromosomes are condensed concentration.Conclusion Drug resistant cell line cell state is restrained，life ability to drop.

Osteosarcoma；Drug resistant cell lines；Morphology

R730.53

A

1672-7606(2014)03-0158-03

2014-05-21

王建軍(1967-)男,河南開(kāi)封人,副主任醫(yī)師,從事臨床腫瘤的診治與研究工作。