替米沙坦對非酒精性脂肪性肝炎大鼠胰島素抵抗及氧化應激的影響

劉應莉 張秋瓚 王艷榮 楊 倩 付麗娜 張 靜

替米沙坦對非酒精性脂肪性肝炎大鼠胰島素抵抗及氧化應激的影響

劉應莉 張秋瓚△王艷榮 楊 倩 付麗娜 張 靜

目的 探討替米沙坦對非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠血脂及氧化應激及胰島素抵抗的影響。方法采用隨機數(shù)字表法將50只雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組、多烯磷脂酰膽堿組、替米沙坦低劑量組和替米沙坦高劑量組，每組10只。對照組以普通飼料喂養(yǎng)，模型組和干預組給予高脂飼料喂養(yǎng)誘發(fā)NASH，12周后，分別給予生理鹽水1.0 mL/(kg·d)、生理鹽水1.0 mL/（kg·d）、多烯磷脂膽堿8.4 mg/(kg·d)、替米沙坦4 mg/(kg·d)和替米沙坦8 mg/(kg·d)灌胃4周。所有大鼠在第16周末處死，測肝酶、血脂、氧化應激、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)等及肝組織NAS評分。結果與模型組比較，多烯磷脂酰膽堿組丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）減低，NAS評分改善；替米沙坦低劑量組AST減低，血清總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、肝組織SOD和GSH-PX提高，血清及肝組織MDA減低，HOMA-IR減低，NAS評分改善；替米沙坦高劑量組ALT減低，余指標變化同替米沙坦低劑量組。結論高劑量的替米沙坦可降低NASH大鼠肝酶、氧化應激、胰島素抵抗和肝臟脂質沉積，且作用優(yōu)于多烯磷脂酰膽堿及低劑量替米沙坦。

氧化性應激；大鼠，Sprague-Dawley；替米沙坦；多烯磷脂酰膽堿;非酒精性脂肪性肝炎；胰島素抵抗

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)是一類配體激活的轉錄因子，在調節(jié)糖脂代謝中具有重要作用，與肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）等多種疾病的發(fā)病相關，PPARs可促進脂質沉積于脂肪組織內，并在脂肪細胞的分化和成熟中起到舉足輕重的作用[1]。替米沙坦與PPARs激動劑吡格列酮化學結構相似，是PPARs部分激動藥，在脂質代謝中具有一定的作用。現(xiàn)普遍觀點認為，NASH發(fā)病中的第1次打擊為肝臟脂質沉積，進一步引起氧化應激和炎癥反應，故通過阻斷以上病理過程來治療NASH具有理論可行性。本研究通過高脂飲食建立大鼠NASH動物模型，并用替米沙坦干預，探討替米沙坦對NASH大鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SPF級SD大鼠50只，6周齡，體質量（200±20）g，購自中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所，并飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室。

1.2 主要試劑 替米沙坦（美卡素，勃林格殷格翰公司），多烯磷脂酰膽堿（易善復，賽諾菲安萬特制藥有限公司）。丙二醛（malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、總抗氧化能力（total anti-oxidation competence, T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GSHPX）試劑盒購自南京建成生物公司。

1.3 方法 實驗動物采用完全隨機數(shù)字表法分為5組，每組10只。對照組以普通混合飼料喂養(yǎng)，12周后以生理鹽水1.0 mL/(kg·d)灌胃4周；模型組、多烯磷脂酰膽堿組、替米沙坦低劑量組及替米沙坦高劑量組采用高脂飼料喂養(yǎng)12周，此后模型組以1.0 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃，多烯磷脂酰膽堿組以8.4 mg/(kg·d)多烯磷脂酰膽堿灌胃，替米沙坦低劑量組以4 mg/(kg·d)替米沙坦灌胃，高劑量組以8 mg/(kg·d)替米沙坦灌胃，并繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)4周。

1.4 肝組織病理 顯微鏡下觀察各組大鼠肝組織病理切片中肝細胞脂肪變程度、小葉內炎癥程度及肝細胞氣球樣變程度，并隨機記20個高倍鏡下非酒精性脂肪性肝病活動度積分（nonalcoholic fatty liver disease activity score,NAS）[2]。

1.5 標本采集與檢測 第12、16周測量大鼠體質量，16周末禁食不禁水12 h，麻醉后處死，心臟采血。全自動生化分析儀檢測丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、三酰甘油（TG）和膽固醇（TC）水平。按照試劑盒說明書操作檢測血清MDA、SOD、T-AOC、GSH-PX、空腹血糖及胰島素水平，計算胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index,HOMA-IR), HOMA-IR=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。取肝臟并觀察其表面及切口情況，稱肝濕質量計算肝臟指數(shù)（肝指數(shù)=肝臟濕質量/體質量×100％）。4％中性甲醛固定部分肝臟標本以制作病理切片，-80℃冰箱凍存肝組織以制作肝勻漿，檢測MDA、SOD、GSH-PX水平。

1.6 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件分析，以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 動物一般情況 所有大鼠均存活。12周及16周時，模型組大鼠體質量均顯著高于對照組。對照組大鼠肝臟正常，模型組大鼠肝臟體積增大，切面帶有油膩感，符合NASH大鼠模型特點。16周時，多烯磷脂酰膽堿及高劑量替米沙坦可顯著減緩高脂飲食引起的大鼠體質量增長并降低肝指數(shù)（P＜0.05），低劑量替米沙坦無顯著減緩NASH大鼠體質量增長及降低肝指數(shù)作用（P＞0.05），見表1。

2.2 肝組織病理學 對照組肝組織結構正常。模型組肝組織的肝小葉結構尚正常，可見重度肝細胞脂肪變性、氣球樣變及小葉內炎癥，符合NASH肝臟病理表現(xiàn)，造模成功。多烯磷脂酰膽堿及低劑量替米沙坦可顯著減低NASH大鼠肝組織NAS評分，高劑量替米沙坦可改善肝組織脂肪變和NAS評分，見表2、圖1。

Tab.1 The weight of rats in each group表1 各組大鼠體質量 （n=10，±s）

Tab.1 The weight of rats in each group表1 各組大鼠體質量 （n=10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與對照比較，b與模型組比較，c與多烯磷脂酰膽堿組比較,P＜0.05；表2～4同

組別對照組模型組多烯磷脂酰膽堿組替米沙坦低劑量組替米沙坦高劑量組F體質量（g）12周457.21±34.41 528.84±32.85a526.31±46.25a528.10±40.93a530.68±39.05a6.670＊＊16周484.80±33.69 582.65±33.59a538.53±39.46ab570.46±34.72a532.72±40.85ab10.903＊＊肝指數(shù)（％）2.98±0.29 4.01±0.15a3.54±0.12ab3.89±0.14a3.75±0.03ab54.157＊＊

Tab.2 The liver issue steatosis and NAS score表2 肝組織脂肪變及NAS評分 （n=10，±s）

Tab.2 The liver issue steatosis and NAS score表2 肝組織脂肪變及NAS評分 （n=10，±s）

組別對照組模型組多烯磷脂酰膽堿組替米沙坦低劑量組替米沙坦高劑量組F脂肪變0 2.91±0.32a2.63±0.52a2.58±0.73a2.41±0.75ab52.438＊＊NAS評分0.40±0.52 7.70±0.48a5.74±0.50ab5.92±1.29ab4.90±1.45ab55.371＊＊

2.3 生化指標 模型組大鼠血清ALT、AST、TG、TC均高于對照組（P＜0.05），符合NASH模型特點。藥物干預后，與模型組比，低劑量替米沙坦可顯著降低NASH大鼠的AST水平，高劑量替米沙坦可以顯著降低NASH大鼠ALT和AST水平。多烯磷脂酰膽堿組的AST較替米沙坦高劑量組和替米沙坦低劑量組更低。3組藥物均無降低NASH大鼠TG的作用，見表3。

2.4 HOMA-IR 模型組大鼠HOMA-IR顯著高于對照組（P＜0.05）。低、高劑量的替米沙坦均可顯著改善NASH大鼠HOMA-IR，多烯磷脂膽堿無此作用，見表3。

Tab.3 Biochemical indexs of rats in each group表3 各組大鼠生化指標 （n=10，±s）

Tab.3 Biochemical indexs of rats in each group表3 各組大鼠生化指標 （n=10，±s）

組別對照組模型組多烯磷脂酰膽堿組替米沙坦低劑量組替米沙坦高劑量組F ALT(U/L) 40.8±8.7 112.1±23.4a74.3±14.6ab104.5±20.6ac87.0±12.1ab28.255＊＊AST(U/L) 93.2±12.1 248.2±24.8a120.7±11.9ab196.4±11.3abc154.3±24.9abc114.661＊＊組別對照組模型組多烯磷脂酰膽堿組替米沙坦低劑量組替米沙坦高劑量組F TG(mmol/L) 0.60±0.17 0.78±0.21a0.66±0.11 0.75±0.10 0.71±0.12 2.434 TC(mmol/L) 1.33±0.24 2.52±0.13a2.32±0.31b2.56±0.17 2.42±0.15 57.477＊＊HOMA-IR 2.77±0.42 6.77±0.72a6.87±0.30a4.50±0.53abc3.91±0.62abc112.794＊＊

2.5 血清和肝組織勻漿氧化應激指標 低、高劑量的替米沙坦均可提高血清T-AOC、SOD、GSH-PX、肝組織SOD和GSH-PX等抗氧化應激指標，減低血清及肝組織氧化應激指標MDA水平，而多烯磷脂酰膽堿只能降低NASH大鼠血清及肝組織MDA水平，提高血清T-AOC、GSH-PX水平，見表4。

3 討論

高脂血癥是NASH發(fā)病的首要環(huán)節(jié)，替米沙坦作為血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（angiotensinⅡreceptor,ARB）類藥物，理論上無直接降低血脂合成作用，本研究結果證實替米沙坦無減低NASH大鼠血脂作用。而作為PPARs受體部分激動劑，替米沙坦可以促進脂質沉積于脂肪組織內，減少肝組織脂質沉積[3-4]。本研究顯示高劑量替米沙坦可顯著改善NASH大鼠肝指數(shù)和肝組織脂肪變性，提示替米沙坦可能具有減少肝臟脂質沉積作用。

NASH肝臟攝取過多脂肪酸引起脂肪酸超載，誘發(fā)肝臟線粒體功能和超微結構病變，使線粒體內呼吸鏈復合物的活性下降，引起活性氧積聚，引起機體氧化應激并氧化脂肪，直接破壞線粒體DNA、呼吸鏈多肽，誘導核因子（NF）-κB的活化及肝臟合成腫瘤壞死因子（TNF）-α，引起脂肪性肝炎、壞死、炎癥和纖維化[5]。正常情況下，生物體內清除活性氧的體系包括T-AOC、SOD、CAT、GSH等。T-AOC能分解代謝活性氧，SOD能特異清除超氧陰離子自由基，減少脂質過氧化，過氧化氫酶（CAT）能分解氫氧自由基，GSH-PX可減少羥自由基和單線態(tài)氧的產(chǎn)生，保護機體細胞的穩(wěn)定的內環(huán)境。生物膜中的多不飽和脂肪酸在活性氧族的攻擊下形成脂質過氧化物產(chǎn)物MDA，進一步激活體內多種免疫反應。研究顯示，ARB類藥物可減低NASH肝臟活性氧、一氧化氮合酶（NOS）水平，增加GSH等抗氧化劑水平[6-7]。此外，替米沙坦作為唯一一個能在治療劑量激活PPARs的ARB類藥物，可通過激活PPARs，引起脂肪細胞線粒體氧化脂肪的能力增加[8]，減少氧化應激產(chǎn)物的生成，提示其抗氧化應激作用優(yōu)于其他ARB類。本研究亦證實，替米沙坦能顯著提高NASH大鼠體內抗氧化物T-AOC、SOD、GSH-PX水平，降低氧化產(chǎn)物MDA，減低氧化應激，且高劑量抗氧化應激作用優(yōu)于低劑量。多烯磷脂酰膽堿作為細胞膜穩(wěn)定劑，無全面改善NASH大鼠氧化應激的作用。

Tab.4 Indicators of oxidative stress in rats表4 各組大鼠氧化應激指標 （n=10，±s）

Tab.4 Indicators of oxidative stress in rats表4 各組大鼠氧化應激指標 （n=10，±s）

組別對照組模型組多烯磷脂酰膽堿組替米沙坦低劑量組替米沙坦高劑量組F血清T-AOC (U/mL) 14.83±1.10 8.10±0.67a10.43±1.38b10.10±1.31b10.91±1.63b38.280＊＊血清MDA (μmol/L) 5.02±0.87 6.51±0.70a5.01±0.42b6.19±0.35b5.70±0.22bc14.477＊＊血清SOD (U/mL) 258.19±36.72 154.25±22.91a167.45±30.96 186.10±26.94bc198.59±23.83bc19.623＊＊血清GSH-PX (U/mL) 315.79±21.18 180.64±30.41a300.89±46.33b300.94±34.49b307.08±19.66bc31.291＊＊肝組織MDA (μmol/g) 54.69±6.75 90.20±6.96a79.73±12.30b82.23±11.12b81.71±13.30bc18.525＊＊肝組織SOD (U/mg) 30.97±4.89 10.54±1.64a9.15±2.76 12.31±1.96b14.26±2.67bc87.514＊＊肝組織GSH-PX (U/mg) 15.65±2.13 5.16±1.27a6.43±0.97 6.53±1.50b6.99±1.37b80.448＊＊

胰島素抵抗被認為是NASH發(fā)生的最基本病理生理改變。高脂血癥和氧化應激通過促進TNF-α的釋放，抑制胰島素信號通路[9]，引起胰島素抵抗，增加糖尿病發(fā)生的風險[10]。胰島素抵抗可引起外周脂肪動員作用增加，血清游離脂肪酸（FFA）水平進一步增高，肝臟攝取增多，同時肝內脂肪酸的氧化利用減少，酯化作用增強，TG增多，肝細胞內脂肪堆積形成脂肪肝[11]。臨床試驗證實，替米沙坦可改善代謝綜合征患者的胰島素抵抗[12]，與本研究結論一致。Georgescu等[13]在一項長達20個月的臨床研究中證實替米沙坦降低NASH患者胰島素抵抗作用強于其他ARB藥物，故推測替米沙坦還可能通過激活PPARs發(fā)揮改善胰島素抵抗作用。

Fig.1 Liver tissues of rats（HE,×400）圖1 各組大鼠肝組織（HE,×400）

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（2014-04-28收稿 2014-07-21修回）

（本文編輯 魏杰）

Effects of Telmisartan on Insulin Resistance and Oxidative Stress in Nonalcoholic Steatohepatitis Rats

LIU Yingli,ZHANG Qiuzan△,WANG Yanrong,YANG Qian,FU Lina,ZHANG Jing
Department of Gastroenterology,Tianjin Fourth Central Hospital,Tianjin 300140,China
△

E-mail:qiuzan_zh@sina.com

ObjectiveTo investigate the effects of telmisartan on insulin resistance and oxidative stress in nonalcoholic steatohepatitis(NASH)rats.MethodsFifty male SD rats were randomly divided into five groups:control group,model group,polyene phosphatidylcholine group,low-dose telmisartan group and high-dose telmisartan group by using random number table(n=10 in each group).Control group was given standard food，the other groups were given high fat diet for 12weeks to establish NASH rat model.Then intervention groups were given either normal saline 1.0 mL/(kg·d)or polyene phosphatidylcholine 8.4 mg/(kg·d),or telmisartan 4 mg/(kg·d)or telmisartan 8 mg/(kg·d)for 4 weeks by intragastric adminstration．All rats were sacrificed at the end of the 16th week,the lever of plasma insulin resistance index(HOMA-IR),ALT, AST,TG,TC,MDA,SOD,T-AOC,CAT,GSH-PX and liver homogenate MDA,SOD,GSH-PX and liver NAS scores were tested.ResultsIn polyene phosphatidylcholine treated group,the lever of plasma ALT,AST,HOMA-IR and liver NAS scores were degreased significantly compared with model group.The lever of plasma AST,SOD,T-AOC,CAT,GSH-PX and liver homogenate SOD,GSH-PX,liver NAS scores were improved in both low-dose and high-dose telmisartan groups compared with model group while plasma and liver homogenate MDA,HOMA-IR were reduced significantly in these two groups compared with model group.Besides,plasma ALT was significantly improved in high-dose telmisartan group compared with model group.ConclusionTelmisartan reduce plasma ALT,AST,oxidative stress,HOMA-IR and liver NAS scores in NASH rats.And high-does telmisartan is better than low-dose telmisartan and polyene phosphatidylcholine in treatment effect.

oxidative stress;rats,Sprague-Dawley;telmisartan;polyene phosphatidylcholine;nonalcoholic steatohepatitis;insulin resistance

R575.5

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.011

天津市衛(wèi)生局科技基金資助項目（2012KR04）

天津市第四中心醫(yī)院消化科(郵編300140)

△通訊作者 E-mail：qiuzan_zh@sina.com