新型ALG-g-Lys微膠珠的制備工藝優(yōu)化

龍瑞敏，王士斌，陳宗香

（ 華僑大學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361021）

新型ALG-g-Lys微膠珠的制備工藝優(yōu)化

龍瑞敏，王士斌，陳宗香

（ 華僑大學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361021）

為了提高海藻酸鈣膠珠的穩(wěn)定性，采用海藻酸鹽的改性材料ALG-g-Lys制備微膠珠，通過單因素考察結(jié)合正交設(shè)計(jì)優(yōu)化了ALG-g-Lys微膠珠的制備工藝。優(yōu)化后的制備工藝為:ALG-g-Lys 濃度為15g/L，電壓為8.0kV，推進(jìn)速度為30mm/h，針頭型號(hào)為24G，CaCl2濃度為15g/L。優(yōu)化后制得的微膠珠粒徑均勻，球形度好，拖尾率、半球率和小球率小，平均粒徑為253±40μm。該工作提供了一種新型的載體材料替代海藻酸鹽作為凝膠材料，未來(lái)可適用于醫(yī)藥、食品行業(yè)等領(lǐng)域。

賴氨酸接枝海藻酸鹽；微膠珠；正交設(shè)計(jì)；優(yōu)化

藥物的控制釋放也稱可控給藥體系，由于其對(duì)包埋的藥物或活性物質(zhì)具有保護(hù)和控制釋放速率功能，近十多年來(lái)獲得了廣泛的研究與發(fā)展。載體材料的選擇是其中研究的一個(gè)熱點(diǎn)，當(dāng)前使用的載體材料主要包括天然、半合成和合成高分子三大類，其中海藻酸鹽是一種天然的水凝膠高分子材料，由于其遇Ca2+、Ba2+等二價(jià)陽(yáng)離子具有瞬時(shí)凝膠化的特點(diǎn)，一直受到研究者的親睞[1-3]。

然而海藻酸鈣水凝膠遇到螯合化合物（磷酸鹽、檸檬酸鹽）、非凝膠化離子（鈉離子、鎂離子）或溶液pH值變化時(shí)，海藻酸鈣凝膠中的鈣離子易被置換或發(fā)生溶脹，從而使凝膠逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w而產(chǎn)生膨脹破裂的趨勢(shì)[4-5]。因此，為了提高海藻酸鈣膠珠的穩(wěn)定性，改善藥物控制釋放的效果，目前研究者主要采取以下兩種解決思路。

一是利用其陰離子特性，在膠珠外層裹上一層陽(yáng)離子聚合物薄膜或?qū)訉幼越M裝形成多層薄膜，該聚合物膜具有穩(wěn)定海藻酸鈣膠珠及調(diào)節(jié)藥物控制釋放的功能。當(dāng)前采用的成膜材料很多，包括聚氨基酸材料[6-8]、殼聚糖[9-10]、聚亞基二胍氯化氫[11]等。

另一個(gè)思路則是直接改造基體，將海藻酸鈉進(jìn)行改性，引入新的功能基團(tuán)，利用海藻酸高分子鏈間纏結(jié)和交聯(lián)劑與新官能團(tuán)的相互作用來(lái)穩(wěn)定水凝膠體系，如海藻酸鈉的雙丙酮丙烯酰胺[12]等。

本工作則采用基體改造思路，利用新的合成材料——賴氨酸接枝海藻酸鹽（ALG-g-Lys）材料替代海藻酸鹽。ALG-g-Lys分子鏈上剩余有較多的自由羧基，可以與Ca2+快速形成“蛋格”結(jié)構(gòu)而凝膠化。利用該特性可將ALG-g-Lys溶液經(jīng)注射泵推進(jìn)，在高壓電場(chǎng)中噴射入CaCl2溶液中，快速形成微米級(jí)的膠珠?？疾炝酥苽錀l件（ALG-g-Lys濃度、電壓、針頭內(nèi)徑、注射泵推進(jìn)速度、不同溶劑、CaCl2濃度）對(duì)微膠珠形成的影響，以期提供一種新的載體形式。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

賴氨酸接枝海藻酸鹽（ALG-g-Lys，Mw660000，實(shí)驗(yàn)室合成）；無(wú)水氯化鈣、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀，均為分析純，購(gòu)自汕頭市西隴化工廠有限公司。

BS210S電子分析天平（德國(guó)Sartorius）；TG2671CS高壓靜電裝置（廈門賽賢電子科技公司）；HI8424C pH計(jì)（北京哈納科儀科技公司）；XSP-3C生物顯微鏡（上海尚光顯微鏡有限公司）。

1.2 單因素考察微膠珠制備工藝

采用高壓靜電裝置制備Ca2+凝膠化的ALG-g-Lys膠珠，并用單因素法考察膠珠制備的影響因素，分別從ALG-g-Lys濃度、電壓、針頭內(nèi)徑、注射泵推進(jìn)速度、不同溶劑的不同水平來(lái)考察，以膠珠的球形度和平均粒徑為主要的考察指標(biāo)。從單因素結(jié)果選定對(duì)高壓靜電法制備的膠珠有影響的因素及相應(yīng)的水平，利用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，得到制備膠珠的最佳參數(shù)。

高壓靜電制備膠珠的過程可參考文獻(xiàn)[13-15]，基本條件：電壓9kV，推進(jìn)速度30mm/h，針頭與液面距20mm，針頭型號(hào)為23G針頭（對(duì)應(yīng)針頭內(nèi)徑0.39mm），ALG-g-Lys濃度15g/L，CaCl2濃度20g/L。

1.3 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化微膠珠制備工藝

正交實(shí)驗(yàn)中固定溶解ALG-g-Lys的溶劑為pH 值7.4的PBS緩沖液，針頭距液面的距離為20mm，正交實(shí)驗(yàn)以ALG-g-Lys濃度、電壓、推進(jìn)速度、針頭型號(hào)和CaCl2濃度作為因素設(shè)計(jì)L16（45）的正交實(shí)驗(yàn)。

優(yōu)化考察指標(biāo)為平均粒徑、拖尾率、半球率和小球率。

1.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果選取最優(yōu)實(shí)驗(yàn)參數(shù)實(shí)驗(yàn)并分析。測(cè)定不少于500個(gè)的粒徑，計(jì)算算數(shù)平均粒徑d。

其中，n1、n2、···、nn為式中為具有粒徑d1、d2、···、dn的粒子數(shù)。

將所測(cè)得的粒徑分布數(shù)據(jù)，以粒徑為橫坐標(biāo)，以頻率（每一粒徑范圍的粒子個(gè)數(shù)除以粒子總數(shù)所得的百分率）為縱坐標(biāo)作圖可得粒徑分布直方圖；以各粒徑范圍的頻率對(duì)各粒徑范圍的平均值作圖可得粒徑分布曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素結(jié)果分析

2.1.1 ALG-g-Lys濃度的影響

當(dāng)ALG-g-Lys濃度小于16g/L時(shí)（包括16g/L），膠珠表面均較光滑；當(dāng)ALG-g-Lys濃度大于16g/L時(shí)，膠珠表面較為粗糙。因溶解ALG-g-Lys的溶劑是磷酸鹽緩沖液，而Ca2+會(huì)與一定濃度的磷酸根離子形成水不溶的物資，隨著ALG-g-Lys濃度的增大，凝膠的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)變致密，致使所形成的沉淀包于膠珠內(nèi)部或附于膠珠表面，因而膠珠表面粗糙。當(dāng)ALG-g-Lys濃度為14g/L時(shí)，膠珠大小較為均勻，且球形度較好，幾乎沒有拖尾變形。

由圖1可見，不同ALG-g-Lys濃度制出的膠珠粒徑各不相同；當(dāng)ALG-g-Lys濃度為14g/L時(shí)膠珠粒徑最??；當(dāng)ALG-g-Lys濃度小于14g/L時(shí)，膠珠粒徑隨濃度的增大而減??；當(dāng)ALG-g-Lys濃度大于14g/L時(shí)，膠珠粒徑隨濃度的增大而增大?？赡苁且?yàn)锳LG-g-Lys濃度增大，導(dǎo)致溶液的密度增大，在電場(chǎng)作用下，被拉扯出來(lái)形成膠珠的量增多，致使膠珠的粒徑增大。綜上，當(dāng)ALG-g-Lys濃度為14g/L時(shí)，制出的膠珠粒徑較小且球形度較好，表面光滑。

2.1.2 電壓的影響

由圖2可以看出，在電壓為8.0kV的條件下，膠珠粒徑最小。當(dāng)電壓小于8.0kV時(shí)，膠珠粒徑隨著電壓的增大而減小；當(dāng)電壓大于8.0kV時(shí)，膠珠粒徑變化不大。分析認(rèn)為，當(dāng)電壓較低時(shí)，其產(chǎn)生的電場(chǎng)作用力還不足以完全克服溶液的黏滯力和表面張力，所以形成的膠珠的直徑較大；隨著電壓的升高，電場(chǎng)作用力增大，制得的膠珠直徑就相應(yīng)減?。欢?dāng)電壓大到某一個(gè)值后（8.0kV），膠珠粒徑趨于平穩(wěn)，此時(shí)電場(chǎng)力已經(jīng)難以克服更大的表面張力制備更小粒徑膠珠，因而電場(chǎng)場(chǎng)強(qiáng)的增大對(duì)膠珠的平均粒徑?jīng)]有顯著的影響。

圖1 不同ALG-g-Lys濃度微膠珠粒徑折線圖

圖2 不同電壓條件下微膠珠粒徑折線圖

2.1.3 針頭型號(hào)的影響

針頭型號(hào)為23G時(shí)，膠珠大小不一，有拖尾現(xiàn)象；針頭型號(hào)為24G時(shí)，大膠珠較均勻，小微粒較少，拖尾也較少；針頭型號(hào)為25G時(shí)，膠珠拖尾較多，且形狀不規(guī)則的較多；針頭型號(hào)為26G時(shí)，膠珠形狀不規(guī)則的較多，且小微粒的數(shù)目較多。

由圖3可以看出，針頭型號(hào)為23G的膠珠粒徑最大，26G的膠珠粒徑最小，總體趨勢(shì)隨著針頭內(nèi)徑的減小，膠珠粒徑也減小。綜合膠珠形貌與粒徑結(jié)果分析，針頭型號(hào)為24G時(shí)，滴制出的微球較理想。

2.1.4 推進(jìn)速度的影響

注射泵推進(jìn)速度為10mm/h的膠珠形狀非常不規(guī)則且大小非常不均一；注射泵推進(jìn)速度為20mm/h的膠珠大小不均勻且有部分拖尾變形；注射泵推進(jìn)速度為30mm/h的膠珠大球較均勻，小球較少，拖尾也較少；注射泵推進(jìn)速度為40mm/h的膠珠形狀不規(guī)則，但小球較少；注射泵推進(jìn)速度為50mm/h的膠珠形狀不規(guī)則，大小不均一；注射泵推進(jìn)速度為60mm/h的膠珠拖尾較多，但小球較少。由圖4可以看出，注射泵推進(jìn)速度小于30mm/h時(shí)（包括30mm/h），膠珠粒徑幾乎沒有變化；當(dāng)注射泵推進(jìn)速度大于30mm/h時(shí)，膠珠粒徑相差較大。這是因?yàn)橥七M(jìn)速度提高，溶液向針尖的流速增大，形成膠珠的速度增加，能夠形成較大的膠珠，而且，在溶液壓力和電場(chǎng)力的作用下膠珠容易脫落，因而制成的膠珠均勻性好，提高推進(jìn)速度，有利于提高生產(chǎn)效率和膠珠的均勻性，但這也會(huì)使膠珠直徑增大。綜上可以得出，當(dāng)注射泵推進(jìn)速度為30mm/h時(shí)，滴制出來(lái)的膠珠較理想。

圖3 不同針頭內(nèi)徑微膠珠粒徑折線圖

圖4 不同注射泵推進(jìn)速度的微膠珠粒徑折線圖

2.1.5 溶劑的影響

溶劑為溶解ALG-g-Lys的磷酸鹽緩沖液。pH值為5.0時(shí)，膠珠大小不均，有極少部分變形；pH值為5.6時(shí)，膠珠大小不均，有多數(shù)拖尾；pH值為6.8時(shí)，膠珠大小相對(duì)較均勻，但是存在許多粒徑極小的膠珠；pH值為7.4時(shí)，膠珠大小均勻，球形度好。

圖5 不同溶劑條件下微球粒徑折線圖

由圖5可以看出，當(dāng)溶劑為pH 值7.4的磷酸鹽緩沖液時(shí)，膠珠粒徑最小；當(dāng)溶劑為pH 值6.8的磷酸鹽緩沖液時(shí)，膠珠粒徑最大；當(dāng)溶劑pH值在5.0～5.6時(shí)，膠珠粒徑變化不大；當(dāng)6.87.4時(shí)，膠珠粒徑隨pH值的增大而增大。綜上可以看出，溶劑pH值 7.4的磷酸鹽緩沖液時(shí)，滴制出的膠珠較理想。

2.2 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果分析及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

正交設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果分析如表1所示。按照所得粒徑的平均值為考察指標(biāo)，如果希望獲得粒徑小的微膠珠，所得最優(yōu)組合為：a1b2c2d3e1。根據(jù)極差來(lái)判斷，各因素的影響效果為：c>a>d>b>e；按照拖尾率的平均值為考察指標(biāo)，拖尾率越小越好，所得最優(yōu)組合為：a1b2c3d2e4，根據(jù)極差來(lái)判斷，各因素的影響效果為：c>d>a>b>e；按照半球率的平均值為考察指標(biāo)，半球率越小越好，所得最優(yōu)組合為：a4b3c4d4e3，根據(jù)極差來(lái)判斷，各因素的影響效果為：d>a>c>e>b；按照小球率的平均值為考察指標(biāo)，小球率越小膠珠越均勻，所得最優(yōu)組合為：a2b1c3d2e3，根據(jù)極差來(lái)判斷，各因素的影響效果為：a>d>b>c>e。

綜合分析得出最優(yōu)組合：a2b1c3d2e3或a2b2c3d2e3；依次進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。

（1）a2b1c3d2e3組合，即為ALG-g-Lys 濃度為15g/L，電壓為7.5kV，推進(jìn)速度為30mm/h，針頭型號(hào)為24G，CaCl2濃度為15g/L，所得膠珠半球很多。

（2）a2b2c3d2e3組合，即為ALG-g-Lys 濃度為15g/L，電壓為8.0kV，推進(jìn)速度為30mm/h，針頭型號(hào)為24G，CaCl2濃度為15g/L。所得膠珠形貌由圖6可以看出，膠珠大小均勻，結(jié)構(gòu)圓整，極少數(shù)拖尾變形。平均粒徑為253±40μm（圖7），其中在320～340μm的膠珠數(shù)較多，導(dǎo)致粒徑分布曲線較不對(duì)稱。擬合方程為：Y=0.02116+0.2617exp[-0.5× (X-245.96225)/21.45503]2，R2=0.85505。可能是因?yàn)樽⑸浔檬情g歇性工作的，導(dǎo)致推進(jìn)壓力不均勻，通過針頭的溶液不均勻，使膠珠的粒徑在320～340μm有一定數(shù)目的膠珠，這部分膠珠可能為間歇過程中滴出的，因?yàn)樽⑸浔瞄g歇時(shí)，溶液所受的壓力減小，克服黏滯阻力的合力減小，因而膠珠粒徑增大。

圖6 優(yōu)化后微膠珠光鏡照片

圖7 粒徑分布直方圖和正態(tài)擬合曲線

3 結(jié) 論

采用海藻酸鹽的改性材料ALG-g-Lys制備微膠珠，通過單因素考察結(jié)合正交設(shè)計(jì)優(yōu)化了ALG-g-Lys微膠珠的制備工藝，所制得的微膠珠粒徑均勻，結(jié)構(gòu)圓整，拖尾率、半球率和小球率小，平均粒徑為253±40μm。該載體材料可生物降解，其中海藻酸鹽為多糖，降解產(chǎn)物可參與人體自身循環(huán)；賴氨酸為人體必需氨基酸，兼具營(yíng)養(yǎng)作用與藥理功效。該工作提供了一種新型的載體材料替代海藻酸鹽作為凝膠材料，未來(lái)可適用于醫(yī)藥、食品行業(yè)等領(lǐng)域。

表1 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表

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Preparation optimization of novel ALG-g-Lys micro-beads

LONG Ruimin，WANG Shibin，CHEN Zongxiang
（School of Chemical Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，F(xiàn)ujian，China）

A new material，ALG-g-Lys，was used to prepare micro-beads instead of alginate to improve the stability of alginate micro-beads. The preparation process was optimized using the single factor method combined with orthogonal design. The optimized parameters were:ALG-g-Lys concentration 1.5g/L，voltage 8.0kV，advance speed 30mm/h，needle 24G，and CaCl2concentration 15g/L. The prepared micro-beads showed even distribution and good sphericity with low trailing ratio，half sphere ratio and globule ratio. The mean particle size was 253±40μm. This work supplies a novel carrier material instead of alginate to prepare gel，showing bright future in medicine and food industries.

lysine grafted alginate；micro-bead；orthogonal design；optimization

R 318

A

1000-6613（2014）09-2403-06

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.09.028

2014-01-03；修改稿日期：2014-01-17。

國(guó)家自然科學(xué)基金（31000441、31170939）、福建省自然科學(xué)基金（2013J01189）及華僑大學(xué)校級(jí)科研基金（10HZR10）項(xiàng)目。

及聯(lián)系人：龍瑞敏（1979—），女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事生物化工相關(guān)研究。E-mail simplever@126.com。