豬到食蟹猴異種小腸移植后受體凝血功能變化的研究

姚丹華 李幼生 王劍 毛琦 郭明曉 張少一 孔文成 任樂樂 黎介壽

超急性異種排斥反應(yīng)(hyperacute xenograft rejection，HAXR)是決定異種器官在移植后早期能否存活的關(guān)鍵因素［1］。HAXR 是由異種天然抗體介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)，通常發(fā)生在移植器官再灌注后數(shù)分鐘到24 h 內(nèi)。異種天然抗體通過識別異種器官血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的異種抗原，引起補(bǔ)體系統(tǒng)的鏈?zhǔn)郊せ睿瑥亩鴮?dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。內(nèi)皮細(xì)胞大量損傷時，其表達(dá)的抗凝物質(zhì)如組織因子途徑抑制物、抗凝血酶、活化蛋白C、活化蛋白S 等明顯減少;而組織因子、凝血酶等促凝物質(zhì)增加，導(dǎo)致血小板、纖維蛋白等物質(zhì)在血管內(nèi)聚集，引起血栓形成［2］。同時，由于血管內(nèi)皮細(xì)胞的破壞，血液滲出到組織間隙，引起器官間質(zhì)出血。因此，HAXR 的典型病理表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞大量破壞，血管內(nèi)大量抗體、補(bǔ)體沉積，血管內(nèi)血栓形成及組織間質(zhì)廣泛出血［2-3］。實時檢測器官移植受體凝血功能的變化，可以從一定程度上了解HAXR 的發(fā)生情況。我們通過建立豬到食蟹猴異位節(jié)段小腸移植模型，采用常規(guī)凝血功能檢測方法和血栓彈力圖(thrombelastogram，TEG)檢測受體在移植后不同時間點(diǎn)的凝血功能，研究HAXR過程中受體凝血功能變化，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑

供體為3 只雄性白色雜種豬，5 ～6 周齡，體質(zhì)量15 ～18 kg(購自南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科)。術(shù)前12 h 禁食，自由飲水。受體為5 只食蟹猴，雌雄不限，3 ～4 周齡，體質(zhì)量為2.8 ～3.7 kg(購自漢南新正源生物科技有限公司)。術(shù)前8 h 禁食，自由飲水。

主要試劑為活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)檢測試劑盒以及凝血酶原時間(prothrombin time，PT)檢測試劑盒(均為美國Heamoscope 公司)。

1.2 手術(shù)方式

常規(guī)消毒、麻醉后，獲取供體末端回腸約50 cm的小腸，保留支配相關(guān)腸管的腸系膜前動、靜脈分支，分別與受體腎下腹主動脈、腎下下腔靜脈行端側(cè)吻合。保留移植小腸兩端腸管呈結(jié)扎狀態(tài)，不與受體腸管吻合。

1.3 凝血功能檢測

分別采集受體移植前以及移植小腸再灌注后15，30，60，120 min 各時間點(diǎn)的血液標(biāo)本。經(jīng)頸外靜脈取血約2.5 mL，裝入枸櫞酸鈉抗凝采血管，立即行常規(guī)凝血功能檢測和TEG 檢測。

1.4 移植小腸存活情況的判斷

由兩位經(jīng)驗豐富的臨床醫(yī)師連續(xù)觀察移植小腸的存活情況，計算受體移植小腸的存活時間。同時發(fā)現(xiàn)腸黏膜散在出血點(diǎn)、無肉眼可見正常黏膜、腸壁及腸系膜血管搏動消失時，可診斷為移植小腸丟失。當(dāng)判定為移植小腸丟失時，靜脈注射氯化鉀6 g，處死受體。本研究符合動物實驗相關(guān)倫理要求。

2 結(jié) 果

2.1 受體凝血功能的變化

本研究共行豬到食蟹猴異種小腸移植術(shù)5 例。血管吻合成功率為100%，移植小腸中位存活時間為165 min (55 ～245 min)。受體移植前以及移植小腸再灌注后15，30，60，120 min 凝血功能監(jiān)測顯示，受體纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)ib)水平、血小板(platelet，Plt)計數(shù)以及抗凝血酶Ⅲ(antithrombinⅢ，AT Ⅲ)活性在移植小腸再灌注后，呈逐漸下降趨勢，詳見表1。Fib 術(shù)前初始值為(1.81 ±0.24)g/L，再灌注后120 min 降至最低，為(0.76±0.17)g/L;Plt術(shù)前初始值為(340 ±81)×109，再灌注后120 min降至最低，為(155 ±7)×109;AT Ⅲ術(shù)前初始值為(100 ±19)%，再灌注后30 min 降至最低，為(54 ±16)%。受體PT、APTT、D-二聚體以及國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(international normalized ratio，INR)在移植小腸再灌注后，呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。PT 術(shù)前初始值為(11 ±2)s，再灌注后30 min 升至最高，為(20 ±5)s;APPT 術(shù)前初始值為(21 ±3)s，再灌注后30 min 升至最高(88 ±29)s;D-二聚體術(shù)前初始值為(0.09 ±0.07)mg/L，再灌注后60 min 升至最高，為(0.70 ±0.49)mg/L;INR 初始值為1.0 ± 0. 2，再灌注后30 min 升至最高，為1.7 ±0.3。

受體TEG 指標(biāo)中，R 值、K 值及LY30 呈逐漸升高的趨勢，最大振幅(maximun amplitude，MA)數(shù)值呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(表2)。R 值術(shù)前初始值為(6.9 ±1.3)min，再灌注后120 min 升至最高，為(16.8 ±2.7)min;K 值術(shù)前初始值為(2 ±1)min，再灌注后120 min 升至最高，為(15 ±5)min;LY30術(shù)前初始值為(4±2)%，再灌注后60 min 升至最高，為(31 ±7)%;MA 數(shù)值術(shù)前初始為(63 ±5)mm，再灌注后60 min 降至最低，為(25 ±16)mm。TEG 曲線提示，移植前受體凝血功能正常，移植小腸再灌注15，30 min 后，受體凝血功能呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，合并纖溶亢進(jìn);移植小腸再灌注后60，120 min，受體凝血功能表現(xiàn)為消耗性低凝狀態(tài)(圖1)。

表2 受體食蟹猴移植前及移植后各時間點(diǎn)血栓彈力圖指標(biāo)

表2 受體食蟹猴移植前及移植后各時間點(diǎn)血栓彈力圖指標(biāo)

注:MA.最大振幅

例數(shù) R 值(min)K 值(min)LY30(%)MA(%)63 ± 5再灌注后15 min 5 9.5 ±3.2 2 ±1 7 ±3 54 ± 8再灌注后30 min 5 13.0 ±2.2 8 ±2 13 ±5 38 ± 9再灌注后60 min 4 14.3 ±2.1 13 ±3 31 ±7 25 ±16再灌注后120 min 3 16.8 ±2.7 15 ±5 30 ±6移植前 5 6.9 ±1.3 2 ±1 4 ±2 28 ±16

圖1 1 例受體食蟹猴血栓彈力圖曲線的變化趨勢

2.2 移植小腸的病理表現(xiàn)

本研究中，所有受體再灌注后15 min，均發(fā)現(xiàn)典型的HAXR 病理表現(xiàn)。主要表現(xiàn)為移植小腸黏膜充血、水腫、散在出血點(diǎn)以及間質(zhì)出血表現(xiàn)(圖2)。供體正常小腸黏膜為淡粉紅色，無出血點(diǎn)，黏膜皺襞清晰可見(圖3a)。移植小腸再灌注后15 min，腸黏膜呈深粉紅色，伴輕微水腫(圖3b);再灌注后30 min，腸黏膜水腫較前加重，并伴有瘀血及點(diǎn)狀出血(圖3c);再灌注后120 min，腸黏膜水腫嚴(yán)重，出血連成片，伴腸腔內(nèi)滲血(圖3d)。再灌注后120 min，移植小腸大體觀可見水腫，漿膜層點(diǎn)狀出血，腸系膜大量出血點(diǎn)伴水腫(圖4)。

表1 受體食蟹猴移植前及移植后各時間點(diǎn)常規(guī)凝血指標(biāo)(ˉx±s)

圖2 受體食蟹猴移植小腸術(shù)后發(fā)生超急性排斥反應(yīng)的病理表現(xiàn)(HE ×100)

圖3 受體食蟹猴移植前及移植后各時間點(diǎn)移植小腸腸黏膜病理表現(xiàn)

圖4 受體食蟹猴移植腸再灌注后120 min 大體觀

3 討 論

異種器官移植有望成為解決目前供器官嚴(yán)重短缺困難的有效手段之一［4］。但是，由于異種器官細(xì)胞表面存在天然抗原，可導(dǎo)致異種器官移植后早期即出現(xiàn)以內(nèi)皮細(xì)胞破壞、血管內(nèi)血栓、間質(zhì)出血為特征的HAXR［5］。目前，尚沒有較好的血清學(xué)指標(biāo)來反映異種器官移植術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生情況，大多只能根據(jù)移植器官組織病理改變來判斷排斥反應(yīng)的發(fā)生情況。但是，對于某些特殊器官，難以通過反復(fù)活檢獲得足夠的組織標(biāo)本，加大了診斷排斥反應(yīng)的難度。雖然在異種小腸移植動物實驗中，我們可以反復(fù)多次獲取小腸組織標(biāo)本，但是從病理學(xué)角度判斷移植小腸的存活情況存在一定的滯后性，無法實時監(jiān)測移植小腸排斥反應(yīng)發(fā)生情況。由于HAXR引起的血管內(nèi)血栓和移植器官間質(zhì)出血是最終導(dǎo)致異種移植物丟失的原因，故檢測或調(diào)節(jié)凝血指標(biāo)有助于判斷和干預(yù)HAXR。Mohiuddin 等［6］將轉(zhuǎn)基因豬(GTKO/hCD46)的心臟異位移植于狒狒體內(nèi)，移植心臟存活時間達(dá)146 d;而將GTKO/hCD46 轉(zhuǎn)基因豬的基礎(chǔ)上再表達(dá)人血栓調(diào)節(jié)蛋白的3 系轉(zhuǎn)基因豬的心臟移植于狒狒體內(nèi)，移植心臟的存活時間可超過1 年［7］。事實證明，凝血功能的調(diào)節(jié)可以有效減少HAXR 的發(fā)生，并延長移植物的存活時間。研究異種移植受體在移植后凝血功能的變化，可能有助于指導(dǎo)抗凝治療，延長移植物存活期［8］。

本研究采用常規(guī)方法檢測食蟹猴受體各項凝血指標(biāo)，同時還采用TEG 評估凝血酶、血小板及纖維蛋白功能以及纖維蛋白溶解情況，觀察受體不同時間點(diǎn)全方面的凝血狀態(tài)。與傳統(tǒng)凝血項目檢測相比，TEG 將凝血動力學(xué)過程描記為曲線，從而清楚地反映全血凝血過程，包括從凝血開始至血凝塊降解的全過程，涵蓋凝血級聯(lián)反應(yīng)與血小板相互作用的綜合結(jié)果，反映參與凝血過程所有物質(zhì)的綜合狀態(tài)［9-10］。TEG 中的R 值反應(yīng)凝血因子功能，K 值反應(yīng)血凝塊形成速率，MA 反映纖維蛋白和血小板血凝塊最大強(qiáng)度，LY30 值反映纖維蛋白降解速率。本研究中，移植小腸再灌注后15 min，TEG 曲線顯示R 值及K 值減小，LY30 增高，提示受體凝血因子大量活化，纖維蛋白和血小板開始聚集，同時出現(xiàn)繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)，受體此時處于彌散性血管內(nèi)凝血的高凝期。移植小腸再灌注后60，120 min，TEG 曲線提示受體處于消耗性低凝狀態(tài)。Spiezia 等［8］使用TEG 技術(shù)監(jiān)測豬到食蟹猴異種腎移植后受體的凝血功能，通過及時發(fā)現(xiàn)受體消耗性凝血功能障礙，及時對癥治療，成功延長了受體的生存時間?？梢奣EG 可以實時、全面評估凝血狀態(tài)，在指導(dǎo)異種器官移植抗HAXR 治療方面，前景廣闊，意義重大。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)受體凝血功能隨HAXR 的發(fā)生而出現(xiàn)逐漸惡化的趨勢，因此，我們認(rèn)為凝血功能可以在一定程度上反映HAXR 的發(fā)生情況。采用常規(guī)凝血指標(biāo)結(jié)合TEG 來監(jiān)測凝血功能，從而進(jìn)行抗凝、止血干預(yù)，可能會有利于延長異種移植小腸存活時間。

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