波爾山羊MC4R胞內(nèi)3環(huán)基因片段單核苷酸多態(tài)性對體重的影響

張俊等

摘要：為探討黑素皮質(zhì)素受體4（melanocortin receptor-4，MC4R）基因多態(tài)性對波爾山羊生長性狀的影響，對波爾山羊MC4R基因進(jìn)行了克隆測序，篩選多態(tài)性位點。結(jié)果表明：MC4R胞內(nèi)3環(huán)基因片段存在2個堿基顛換，分別是編碼區(qū)663 bp處C/A顛換、693 bp處C/T顛換；其中693 bp處C/T存在于Csp6Ⅰ酶切位點內(nèi)，以此建立了基于 Csp6Ⅰ 酶切的PCR-RFLP檢測方法，并對163只波爾山羊進(jìn)行檢測分析；在受檢波爾山羊中檢測到CC、CT 2種基因型，2種基因型在波爾山羊各月齡體重方面差異均不顯著，且在群體中表現(xiàn)為低度多態(tài)，群體遺傳雜合度較低，表明C693T位點在波爾山羊群體中的遺傳一致性較高。

關(guān)鍵詞：黑素皮質(zhì)素受體4；克??；PCR-RFLP；波爾山羊；生長

中圖分類號： Q343.1+5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0013-03

黑素皮質(zhì)素受體-4（melanocortin receptor-4，MC4R）分布于動物腦組織和腎上腺髓質(zhì)，是從動物下丘腦腹內(nèi)側(cè)核分泌的一種肽類物質(zhì)[1]，其主要作用是通過與腦部分泌的天然內(nèi)源配體α-促黑激素（α-Melanocyte stimulating hormone，α-MSH）結(jié)合，從而抑制體重增加[2]。1993年Gantz等最先克隆出人的MC4R基因，并將其定位于人染色體18q21.3[3]。1997年Huszar等首次證明了MC4R在能量平衡中的關(guān)鍵作用，即遺傳敲除MC4R基因的小鼠出現(xiàn)遺傳性肥胖，表現(xiàn)多食、肥胖、胰島素分泌過多等癥狀[4-5]。此后又有大量研究發(fā)現(xiàn)，MC4R在家畜的背膘厚、日增重、采食量等生長性狀中具有重要生物學(xué)活性，可作為選擇動物生長性狀的遺傳標(biāo)記。本研究對波爾山羊MC4R基因進(jìn)行了克隆和測序，尋找波爾山羊MC4R基因的多態(tài)性位點，分析其多態(tài)性與波爾山羊體重的關(guān)聯(lián)，以期為山羊分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

163只波爾山羊樣本由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動物實驗基地統(tǒng)一飼養(yǎng)管理，營養(yǎng)水平以及管理水平保持一致。各月齡波爾山羊體重資料均由該基地提供。對各個體采集耳組織樣，置冰桶中帶回實驗室，-20 ℃保存。

1.2 組織DNA提取

組織樣DNA的提取采用酚/仿抽提法，TE Buffer 溶解后-20 ℃保存。

1.3 MC4R基因擴(kuò)增

根據(jù)GenBank：EU622853.2設(shè)計引物。上游引物序列：TCCAAGTGATGCCGACCAG，下游引物序列：CTGGGCACTGCTTCACATC。PCR反應(yīng)總體系20 μL，含模板DNA 60 ng，5 U/L Taq聚合酶0.2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，10 μmol/L引物各0.6 μL，25 mmol/L MgCl2 1.2 μL，10×緩沖液2 μL，添加滅菌雙蒸水至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4 克隆與測序

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨機(jī)選取10只波爾山羊的PCR產(chǎn)物用TaKaRa膠回收試劑盒回收后與 PMD-19T 載體連接，16 ℃培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)16 h，挑陽性克隆送上海英駿公司測序。

1.5 突變位點篩選

將11個陽性克隆的測序結(jié)果與GenBank序列對比，確定突變位點。

1.6 PCR-RFLP分析

1.6.1 目的基因擴(kuò)增 根據(jù)測序結(jié)果選擇其中一個突變位點（位于Csp6Ⅰ識別序列內(nèi)），設(shè)計1對引物擴(kuò)增MC4R基因Csp6Ⅰ位點上游158 bp，下游80 bp，共238 bp序列，上游引物序列為GTGTCGGGCGTCTTGTTC，下游引物序列為AGCAGACGACGAAGACCC。PCR反應(yīng)總體系為20 μL，含模板DNA 60 ng，5 U/L Taq聚合酶0.2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，10 μmol/L引物各0.6 μL，25 mmol/L MgCl2 1.2 μL，10×緩沖液2 μL，添加滅菌雙蒸水至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸 15 s，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.6.2 基因型的確定 采用Csp6Ⅰ對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系16 μL，含PCR產(chǎn)物4 μL，10 U/L Csp6Ⅰ0.5 μL，10×緩沖液1 μL，滅菌雙蒸水10.5 μL。37 ℃酶切 3 h。均用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，EB染色，培清JS-780全自動凝膠成像分析儀進(jìn)行成像分析。CC基因型得到238 bp的1個片段，CT基因型得到80、158、238 bp等3個片段。

1.7 數(shù)據(jù)分析

對不同基因型的山羊體重體尺資料采用SPSS軟件的 Independent-Samples T Test工具進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MC4R基因片段的擴(kuò)增

對10只波爾山羊DNA模板分別進(jìn)行MC4R基因片段PCR擴(kuò)增，在1 400 bp左右得到1條特異性條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 測序篩選多態(tài)位點

將10只波爾山羊DNA模板擴(kuò)增得到的MC4R基因片段克隆后進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明在MC4R胞內(nèi)3環(huán)基因片段發(fā)現(xiàn)2個點突變，663 bp處C/A單堿基顛換（圖2），693 bp處C/T單堿基顛換（圖3）。經(jīng)分析693 bp處C/T 變異處于Csp6Ⅰ酶切位點內(nèi)。

2.3 PCR-RFLP檢測方法的建立

對163只波爾山羊樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在238 bp左右得

到1條特異性條帶（圖4），與預(yù)期結(jié)果一致。采用限制性內(nèi)切酶Csp6Ⅰ對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化，結(jié)果出現(xiàn)2種基因型，分別命名為CC、CT。CC基因型得到238 bp 1個片段（圖5，泳道2、3）；CT基因型得到238、158、80 bp 3個片段（圖5，泳道1、4）。

2.4 MC4R基因群體遺傳學(xué)分析

2.4.1 基因型頻率在波爾山羊群體中的分布 在163只受試波爾山羊中，以CC基因型居多，占78.5%；CT基因型較少，占21.5%（表1）；C為優(yōu)勢基因。

2.4.2 遺傳特性分析 由表1可見，C693T位點在波爾山羊群體中均表現(xiàn)為低度多態(tài)[多態(tài)信息含量（PIC）<0.25）]，而且群體遺傳雜合度較低，表明該多態(tài)位點在波爾山羊群體中的選擇潛力不大，遺傳一致性較高。

2.5 不同基因型對波爾山羊體重的影響

對受檢波爾山羊C693T位點2種基因型的山羊體重進(jìn)行t檢驗，結(jié)果表明各月齡山羊體重差異均不顯著（表2）。

3 結(jié)論與討論

大量研究表明，MC4R基因在動物采食和能量平衡調(diào)控中起關(guān)鍵作用，目前已發(fā)現(xiàn)豬、牛、兔、犬、雞等動物的MC4R基因存在與體重性狀相關(guān)的SNPs。Kim等首次報道MC4R基因Asp298Asn突變與豬的背膘厚、生長速度、采食量顯著相關(guān)[6]。劉洪瑜等發(fā)現(xiàn)，牛的MC4R基因1069 C/G突變顯著影響了體斜長及胸圍[7]。蔣美山等對兔MC4R基因237 bp處A/G突變的研究顯示，該位點顯著影響兔體重、全凈膛重、飼料轉(zhuǎn)化率[8]。張軼博等發(fā)現(xiàn)，比格犬MC4R基因226 bp處的C/A變異與體重顯著相關(guān)[9]。仇雪梅等發(fā)現(xiàn)，MC4R基因5′調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)的4個突變對雞體重、屠體性狀有顯著影響[10]。曾獻(xiàn)存等發(fā)現(xiàn)，不同MC4R基因的中國美利奴羊體斜長和腰角寬差異顯著[11]。但山羊MC4R基因多態(tài)性及其與生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)分析未見報道。

已有研究顯示，MC4R的胞內(nèi)3環(huán)對于MC4R與G蛋白的偶聯(lián)活性十分重要[12]。通過克隆測序，本研究發(fā)現(xiàn)波爾山羊MC4R胞內(nèi)3環(huán)基因片段存在2個SNPs，即C663A、C693T，均為無義突變，不引起氨基酸的改變。其中693 bp處的C/T單堿基顛換導(dǎo)致產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶Csp6Ⅰ識別位點，據(jù)此建立了該SNP位點的PCR-RFLP檢測方法。通過對163只波爾山羊檢測發(fā)現(xiàn)，只檢測出2種基因型，以CC型居多，CT型較少，C為優(yōu)勢基因。t檢驗表明，檢測出的2種基因型在受檢波爾山羊各月齡體重方面差異均不顯著，且該位點在波爾山羊群體中表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC<0.25），說明其在波爾山羊群體中的選擇潛力不大。但該位點在波爾山羊群體中是否均只存在2種基因型及其對體重的影響，以及C663A位點對體重、體尺性狀的影響，還須要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Yeo G S，F(xiàn)arooqi I S，Challis B G，et al. The role of melanocortin signalling in the control of body weight：evidence from human and murine genetic models[J]. QJM：Monthly Journal of the Association of Physicians，2000，93（1）：7-14.

[2]Sinha P S，Schioth H B，Tatro J B. Roles of the melanocortin-4 receptor in antipyretic and hyperthermic actions of centrally administered alpha-MSH[J]. Brain Research，2004，1001（1/2）：150-158.

[3]Gantz I，Miwa H，Konda Y，et al. Molecular cloning，expression，and gene localization of a fourth melanocortin receptor[J]. The Journal of Biological Chemistry，1993，268（20）：15174-15179.

[4]Huszar D，Lynch C A，F(xiàn)airchild-Huntress V，et al. Targeted disruption of the melanocortin-4 receptor results in obesity in mice[J]. Cell，1997，88（1）：131-141.

[5]方曉敏，孟搖翠，任守文，等. 6個主效基因在蘇鐘豬分子育種中的應(yīng)用價值[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，28（5）：1074-1078.

[6]Kim K S，Larsen N，Short T，et al. A missense variant of the porcine melanocortin-4 receptor （MC4R） gene is associated with fatness，growth，and feed intake traits[J]. Mammalian Genome，2000，11（2）：131-135.

[7]劉洪瑜，王 恒，任春環(huán)，等. 牛MC4R基因多態(tài)性與體尺性狀的相關(guān)分析[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2012，32（9）：1309-1311，1343.

[8]蔣美山，陳仕毅，賴松家，等. 兔黑素皮質(zhì)素受體4（MC4R）基因多態(tài)性及其與體重及屠體性狀的關(guān)聯(lián)研究[J]. 遺傳，2008，30（12）：1574-1578.

[9]張軼博，巴彩鳳，蘇玉虹，等. 比格犬MC4R基因多態(tài)性與體重相關(guān)性的研究[J]. 遺傳，2006，28（10）：1224-1228.

[10]仇雪梅，李 寧，鄧學(xué)梅，等. 雞MC4R基因的SNPs及其與屠體性狀的相關(guān)研究[J]. 中國科學(xué)：C輯，2006，36（2）：127-133.

[11]曾獻(xiàn)存，陳韓英，賈 斌，等. MC4R和PROP1基因多態(tài)性及合并基因型與中國美利奴羊生長性狀的關(guān)聯(lián)分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2011，42（9）：1227-1232.

[12]Kim D H，Shin S W，Baik J H. Role of third intracellular loop of the melanocortin 4 receptor in the regulation of constitutive activity[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，365（3）：439-445.

2.3 PCR-RFLP檢測方法的建立

對163只波爾山羊樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在238 bp左右得

到1條特異性條帶（圖4），與預(yù)期結(jié)果一致。采用限制性內(nèi)切酶Csp6Ⅰ對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化，結(jié)果出現(xiàn)2種基因型，分別命名為CC、CT。CC基因型得到238 bp 1個片段（圖5，泳道2、3）；CT基因型得到238、158、80 bp 3個片段（圖5，泳道1、4）。

2.4 MC4R基因群體遺傳學(xué)分析

2.4.1 基因型頻率在波爾山羊群體中的分布 在163只受試波爾山羊中，以CC基因型居多，占78.5%；CT基因型較少，占21.5%（表1）；C為優(yōu)勢基因。

2.4.2 遺傳特性分析 由表1可見，C693T位點在波爾山羊群體中均表現(xiàn)為低度多態(tài)[多態(tài)信息含量（PIC）<0.25）]，而且群體遺傳雜合度較低，表明該多態(tài)位點在波爾山羊群體中的選擇潛力不大，遺傳一致性較高。

2.5 不同基因型對波爾山羊體重的影響

對受檢波爾山羊C693T位點2種基因型的山羊體重進(jìn)行t檢驗，結(jié)果表明各月齡山羊體重差異均不顯著（表2）。

3 結(jié)論與討論

大量研究表明，MC4R基因在動物采食和能量平衡調(diào)控中起關(guān)鍵作用，目前已發(fā)現(xiàn)豬、牛、兔、犬、雞等動物的MC4R基因存在與體重性狀相關(guān)的SNPs。Kim等首次報道MC4R基因Asp298Asn突變與豬的背膘厚、生長速度、采食量顯著相關(guān)[6]。劉洪瑜等發(fā)現(xiàn)，牛的MC4R基因1069 C/G突變顯著影響了體斜長及胸圍[7]。蔣美山等對兔MC4R基因237 bp處A/G突變的研究顯示，該位點顯著影響兔體重、全凈膛重、飼料轉(zhuǎn)化率[8]。張軼博等發(fā)現(xiàn)，比格犬MC4R基因226 bp處的C/A變異與體重顯著相關(guān)[9]。仇雪梅等發(fā)現(xiàn)，MC4R基因5′調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)的4個突變對雞體重、屠體性狀有顯著影響[10]。曾獻(xiàn)存等發(fā)現(xiàn)，不同MC4R基因的中國美利奴羊體斜長和腰角寬差異顯著[11]。但山羊MC4R基因多態(tài)性及其與生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)分析未見報道。

已有研究顯示，MC4R的胞內(nèi)3環(huán)對于MC4R與G蛋白的偶聯(lián)活性十分重要[12]。通過克隆測序，本研究發(fā)現(xiàn)波爾山羊MC4R胞內(nèi)3環(huán)基因片段存在2個SNPs，即C663A、C693T，均為無義突變，不引起氨基酸的改變。其中693 bp處的C/T單堿基顛換導(dǎo)致產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶Csp6Ⅰ識別位點，據(jù)此建立了該SNP位點的PCR-RFLP檢測方法。通過對163只波爾山羊檢測發(fā)現(xiàn)，只檢測出2種基因型，以CC型居多，CT型較少，C為優(yōu)勢基因。t檢驗表明，檢測出的2種基因型在受檢波爾山羊各月齡體重方面差異均不顯著，且該位點在波爾山羊群體中表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC<0.25），說明其在波爾山羊群體中的選擇潛力不大。但該位點在波爾山羊群體中是否均只存在2種基因型及其對體重的影響，以及C663A位點對體重、體尺性狀的影響，還須要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Yeo G S，F(xiàn)arooqi I S，Challis B G，et al. The role of melanocortin signalling in the control of body weight：evidence from human and murine genetic models[J]. QJM：Monthly Journal of the Association of Physicians，2000，93（1）：7-14.

[2]Sinha P S，Schioth H B，Tatro J B. Roles of the melanocortin-4 receptor in antipyretic and hyperthermic actions of centrally administered alpha-MSH[J]. Brain Research，2004，1001（1/2）：150-158.

[3]Gantz I，Miwa H，Konda Y，et al. Molecular cloning，expression，and gene localization of a fourth melanocortin receptor[J]. The Journal of Biological Chemistry，1993，268（20）：15174-15179.

[4]Huszar D，Lynch C A，F(xiàn)airchild-Huntress V，et al. Targeted disruption of the melanocortin-4 receptor results in obesity in mice[J]. Cell，1997，88（1）：131-141.

[5]方曉敏，孟搖翠，任守文，等. 6個主效基因在蘇鐘豬分子育種中的應(yīng)用價值[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，28（5）：1074-1078.

[6]Kim K S，Larsen N，Short T，et al. A missense variant of the porcine melanocortin-4 receptor （MC4R） gene is associated with fatness，growth，and feed intake traits[J]. Mammalian Genome，2000，11（2）：131-135.

[7]劉洪瑜，王 恒，任春環(huán)，等. 牛MC4R基因多態(tài)性與體尺性狀的相關(guān)分析[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2012，32（9）：1309-1311，1343.

[8]蔣美山，陳仕毅，賴松家，等. 兔黑素皮質(zhì)素受體4（MC4R）基因多態(tài)性及其與體重及屠體性狀的關(guān)聯(lián)研究[J]. 遺傳，2008，30（12）：1574-1578.

[9]張軼博，巴彩鳳，蘇玉虹，等. 比格犬MC4R基因多態(tài)性與體重相關(guān)性的研究[J]. 遺傳，2006，28（10）：1224-1228.

[10]仇雪梅，李 寧，鄧學(xué)梅，等. 雞MC4R基因的SNPs及其與屠體性狀的相關(guān)研究[J]. 中國科學(xué)：C輯，2006，36（2）：127-133.

[11]曾獻(xiàn)存，陳韓英，賈 斌，等. MC4R和PROP1基因多態(tài)性及合并基因型與中國美利奴羊生長性狀的關(guān)聯(lián)分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2011，42（9）：1227-1232.

[12]Kim D H，Shin S W，Baik J H. Role of third intracellular loop of the melanocortin 4 receptor in the regulation of constitutive activity[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，365（3）：439-445.

2.3 PCR-RFLP檢測方法的建立

對163只波爾山羊樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在238 bp左右得

到1條特異性條帶（圖4），與預(yù)期結(jié)果一致。采用限制性內(nèi)切酶Csp6Ⅰ對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化，結(jié)果出現(xiàn)2種基因型，分別命名為CC、CT。CC基因型得到238 bp 1個片段（圖5，泳道2、3）；CT基因型得到238、158、80 bp 3個片段（圖5，泳道1、4）。

2.4 MC4R基因群體遺傳學(xué)分析

2.4.1 基因型頻率在波爾山羊群體中的分布 在163只受試波爾山羊中，以CC基因型居多，占78.5%；CT基因型較少，占21.5%（表1）；C為優(yōu)勢基因。

2.4.2 遺傳特性分析 由表1可見，C693T位點在波爾山羊群體中均表現(xiàn)為低度多態(tài)[多態(tài)信息含量（PIC）<0.25）]，而且群體遺傳雜合度較低，表明該多態(tài)位點在波爾山羊群體中的選擇潛力不大，遺傳一致性較高。

2.5 不同基因型對波爾山羊體重的影響

對受檢波爾山羊C693T位點2種基因型的山羊體重進(jìn)行t檢驗，結(jié)果表明各月齡山羊體重差異均不顯著（表2）。

3 結(jié)論與討論

大量研究表明，MC4R基因在動物采食和能量平衡調(diào)控中起關(guān)鍵作用，目前已發(fā)現(xiàn)豬、牛、兔、犬、雞等動物的MC4R基因存在與體重性狀相關(guān)的SNPs。Kim等首次報道MC4R基因Asp298Asn突變與豬的背膘厚、生長速度、采食量顯著相關(guān)[6]。劉洪瑜等發(fā)現(xiàn)，牛的MC4R基因1069 C/G突變顯著影響了體斜長及胸圍[7]。蔣美山等對兔MC4R基因237 bp處A/G突變的研究顯示，該位點顯著影響兔體重、全凈膛重、飼料轉(zhuǎn)化率[8]。張軼博等發(fā)現(xiàn)，比格犬MC4R基因226 bp處的C/A變異與體重顯著相關(guān)[9]。仇雪梅等發(fā)現(xiàn)，MC4R基因5′調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)的4個突變對雞體重、屠體性狀有顯著影響[10]。曾獻(xiàn)存等發(fā)現(xiàn)，不同MC4R基因的中國美利奴羊體斜長和腰角寬差異顯著[11]。但山羊MC4R基因多態(tài)性及其與生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)分析未見報道。

已有研究顯示，MC4R的胞內(nèi)3環(huán)對于MC4R與G蛋白的偶聯(lián)活性十分重要[12]。通過克隆測序，本研究發(fā)現(xiàn)波爾山羊MC4R胞內(nèi)3環(huán)基因片段存在2個SNPs，即C663A、C693T，均為無義突變，不引起氨基酸的改變。其中693 bp處的C/T單堿基顛換導(dǎo)致產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶Csp6Ⅰ識別位點，據(jù)此建立了該SNP位點的PCR-RFLP檢測方法。通過對163只波爾山羊檢測發(fā)現(xiàn)，只檢測出2種基因型，以CC型居多，CT型較少，C為優(yōu)勢基因。t檢驗表明，檢測出的2種基因型在受檢波爾山羊各月齡體重方面差異均不顯著，且該位點在波爾山羊群體中表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC<0.25），說明其在波爾山羊群體中的選擇潛力不大。但該位點在波爾山羊群體中是否均只存在2種基因型及其對體重的影響，以及C663A位點對體重、體尺性狀的影響，還須要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

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