吉富羅非魚核DNA含量的測定

鄒芝英等

摘要：以吉富羅非魚的外周血細胞為樣本、小鼠淋巴細胞DNA為標(biāo)準(zhǔn)（7.0 pg/2C），采用流式細胞術(shù)結(jié)合內(nèi)標(biāo)法測定血細胞的核DNA含量。結(jié)果顯示：吉富羅非魚的核DNA含量為小鼠淋巴細胞的0.339 2±0.009 0倍，絕對含量為（2.374 5±0.063 0） pg/2C。

關(guān)鍵詞：吉富羅非魚；流式細胞術(shù)；DNA含量

中圖分類號： S917.4 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0036-03

羅非魚（Tilapia），俗稱非洲鯽魚，以其生長快、食性雜和適應(yīng)性強等優(yōu)勢成為國際上養(yǎng)殖最廣泛的品種之一，是國際貿(mào)易第三大水產(chǎn)品。中國的羅非魚產(chǎn)量占全球總產(chǎn)量的一半，其出口量高居世界第一位[1]。吉富品系尼羅羅非魚（genetically improved farmed Tilapia Oreochromis niloticus，GIFT，簡稱吉富羅非魚）是中國主要養(yǎng)殖的羅非魚品種（系）之一，也是中國養(yǎng)殖的羅非魚品種中生長最快的品種（系）之一。吉富羅非魚是由國際水生生物資源管理中心、挪威水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所和菲律賓的一些國家級研究機構(gòu)通過對4個非洲原產(chǎn)地（埃及、加納、肯尼亞、塞內(nèi)加爾）直接引進的尼羅羅非魚品系和4個在亞洲地區(qū)（以色列、新加坡、泰國、中國臺灣）廣泛養(yǎng)殖的尼羅羅非魚品系進行混合選育進而獲得的優(yōu)良品系[2]。經(jīng)過近20年的種內(nèi)群體間雜交和選育，該品系已經(jīng)顯示出優(yōu)越的生長優(yōu)勢和潛能[3-4]，引起了亞太地區(qū)的廣泛興趣和關(guān)注，多個國家進行了引種并啟動了對其進一步改良和推廣的國家育種計劃[5]。為了促進中國羅非魚養(yǎng)殖持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)展，2006年8月世界漁業(yè)中心向中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心輸送了60個家系的吉富羅非魚，以期在中國進行吉富羅非魚的選育和推廣工作，這是中國第一次引進如此多家系的吉富羅非魚。目前研究人員已經(jīng)對該群體進行了連續(xù)3代的家系選育，同時開展了對不同家系的生長性能[6-7]、遺傳多樣性[8-9]等方面的評估工作。

脫氧核糖核酸（DNA）是絕大多數(shù)生物體內(nèi)的遺傳物質(zhì)，一個細胞核中所含的DNA總量對于某物種是一定的。生物DNA含量的研究不但是研究物種間差別的重要方法，而且對分類和系統(tǒng)演化的探討、物種進化研究等具有參考意義，同時也是種質(zhì)資源和種質(zhì)質(zhì)量的主要指標(biāo)之一。本試驗對我國新引進的吉富羅非魚群體中的DNA含量進行測定，以期為吉富羅非魚的人工選育和種質(zhì)資源評價等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 試驗用吉富羅非魚取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興養(yǎng)殖基地，為同一批繁殖的苗種。將所有的魚在重量為20 g左右時進行PIT（passive tntegrated transponder）標(biāo)記，然后在同一池塘內(nèi)養(yǎng)殖300 d，再測定每尾魚的體質(zhì)量、體長、體高、體厚等，并計算300 d的增重。從試驗用羅非魚中隨機抽取其3個家系（A、B、C），A家系13尾，B、C家系各15尾，共43尾，分別記為A1～A13、B1～B15、C1～C15；其中雌魚20尾，雄魚23尾。試驗用昆明種小白鼠由衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點實驗室江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所惠贈。

1.1.2 儀器與試劑 FACSCalibur流式細胞儀，BD公司。碘化丙啶（propidiamiodide，PI）購自 Sigma 公司；RNase購自 Sigma 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 單細胞懸液的制備及固定 取4周齡的昆明種小白鼠，斷頸處死后剖腹，剪開胸骨，可見心臟上方灰白色柔軟的組織塊，即胸腺。分離周圍組織，取下胸腺并用PBS清洗。輕壓組織塊得渾濁的液體，用200 μm細胞篩過濾，即得單細胞懸液。1 000 r/min離心15 min后棄上清，加PBS緩沖液重懸沉淀物并計數(shù)。調(diào)整細胞濃度，使加入的預(yù)冷100%乙醇變?yōu)?0%濃度時，淋巴細胞濃度調(diào)整為106個/mL。-20 ℃ 固定過夜或者冷藏待用。

從試驗魚尾靜脈取約0.5 mL血（用ACD抗凝劑濕潤注射器，以防凝固），嚴防溶血。4 ℃靜置過夜后用PBS緩沖液將魚血稀釋，清洗1次后重懸于PBS溶液中并用血細胞計數(shù)板計數(shù)。加入預(yù)冷的70%乙醇-PBS混合液，并調(diào)整細胞濃度至106個/mL，-20 ℃固定過夜或者冷藏待用。

1.2.2 PI染色 分別取0.5 mL小鼠淋巴細胞固定液和魚血固定液，混合、離心去除固定液后用PBS緩沖液清洗1次，重懸于1 mL的PI-PBS（PI濃度為50 μg/mL）染色液中，加入2 μL 100 mg/μL RNase，避光孵育 0.5 h后過200 μm細胞篩，上機檢測。

1.2.3 樣品檢測 采用 FACSCalibur 流式細胞儀測定各樣品的熒光密度值（PI fluorescence），流速控制在低速（12 μL/min），每次檢測10 000個細胞。由流式細胞儀自帶的數(shù)據(jù)處理軟件CELLQuest Pro自動計算每次檢測樣品的平均熒光密度值。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 每次檢測樣品的細胞核DNA含量依照以下公式計算：P1=E2/E1×P2。式中：P1表示魚血細胞的DNA含量，pg；P2表示對照小鼠細胞的DNA含量，pg；E1表示魚血細胞的平均熒光密度值；E2表示雞血細胞的平均熒光密度值。小鼠淋巴細胞的DNA絕對含量以7.0 pg/2C為標(biāo)準(zhǔn)[10]。用流式細胞儀自帶的數(shù)據(jù)處理軟件ModFit軟件分析細胞周期。所有試驗數(shù)據(jù)均用 SPSS 10.0進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 吉富羅非魚的細胞周期

吉富羅非魚細胞與小鼠淋巴細胞的熒光密度峰的相對位置見圖1。ModFit軟件分析表明，小鼠淋巴細胞的熒光密度峰（M2）只有1個G0/G1峰，不表現(xiàn)出細胞周期現(xiàn)象；吉富羅非魚的紅細胞存在2個熒光密度峰，第1個峰值（M1）約占95%左右，為G0/G1期細胞；G0/G1峰值后是1段比例很小的峰谷，約占3.5%左右，為S期；緊接著又有1段峰值約為25%的G2期和M期。

2.2 吉富羅非魚的細胞核DNA含量

采用流式細胞儀對吉富羅非魚的血細胞DNA含量進行了測定，詳見圖1、表1?？梢钥闯黾涣_非魚血細胞的平均熒光密度值為200.33±11.260 2，小鼠淋巴細胞的平均熒光密度值為590.50±28.302 9，兩者比值0.339 2±0.009 0。以小鼠淋巴細胞DNA的絕對含量值7.0 pg/2C作為標(biāo)準(zhǔn)，可以算出吉富羅非魚的血細胞DNA絕對含量為（2.374 5±0.063 0） pg/2C。

3 討論

研究魚類的種質(zhì)參數(shù)、掌握該魚的種質(zhì)特征對于人工育種都具有一定的指導(dǎo)意義。DNA含量分析是種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中不可缺少的參數(shù)之一。近年來測定魚類細胞DNA含量的方法主要是采用顯微分光光度計和流式細胞儀2種方法[11]，從目前的技術(shù)水平來看，采用流式細胞儀測定魚類DNA含量要比采用顯微分光光度計法更準(zhǔn)確些。流式細胞儀是70年代發(fā)展起來的一種利用流式細胞儀對細胞等生物粒子的理化及生物學(xué)特性（細胞大小、DNA/RNA、細胞表面抗原表達等）進行相關(guān)檢測分析的高技術(shù)儀器，具有快速、準(zhǔn)確、采集數(shù)據(jù)量大（速度可達1 000～10 000個/s）、分析全面和操作簡單等優(yōu)點，目前已廣泛運用于魚類、蝦類等DNA含量和倍性的檢測中[12-14]。到目前為止，用流式細胞儀測定魚類細胞含量的方法已比較完善和普遍。此外，流式細胞儀對樣品需求量少，只需要微量魚血即可，使得對試驗魚的傷害減至最低。

對于同一種生物而言，體細胞的DNA含量是恒定的，具有種的特征，在親緣關(guān)系相近的類群中可以作為探討其演化地位和親緣關(guān)系的依據(jù)[13]。吳洪喜等測定得毛蚶（Scapharca subcrenata Lischke）與魁蚶（Scapharca broughtonii Schrenck）的DNA含量高度一致，表明兩者之間的親緣關(guān)系接近，但泥蚶（Arca granosa）的DNA含量則稍高于毛蚶和魁蚶，因此認為泥蚶在進化程度上與毛蚶和魁蚶相近且比它們要高級[14]。方旅平等研究發(fā)現(xiàn)，日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）與刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）DNA含量的絕對值相差不大，因而推知這2種蝦在系統(tǒng)發(fā)生上具有相近的親緣關(guān)系，這與形態(tài)學(xué)上的分類系統(tǒng)是一致的[15]。顧若波等研究發(fā)現(xiàn)，似刺鳊（Paracanthobrama guichenoti Bleeker）的細胞核DNA含量與同亞科的花（Hemibarbus maculatus Bleeker）接近[16]。本試驗利用流式細胞術(shù)測得吉富羅非魚血細胞核DNA含量為（2.374 5±0.063 0）pg/2C，與已報道的尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的（2.27±0.07）pg/2C、奧利亞羅非魚（O. aureus）的（2.22±0.08）pg/2C[17]和星洲紅魚（Red Tilapia）的（2.46±0.09）pg/2C[18]相近，這與4種羅非魚親緣關(guān)系接近是一致的。

常見的參照標(biāo)準(zhǔn)有雞血細胞、人淋巴細胞、小鼠淋巴細胞、鱉血細胞、鱒魚紅細胞及鮭魚紅細胞等[11]。雞血細胞具有來源豐富、著色性好、大小均勻等優(yōu)點，并且在大量研究中被廣泛應(yīng)用，而且雞血細胞與羅非魚的DNA含量相近，比值接近[17]。采用內(nèi)標(biāo)法檢測發(fā)現(xiàn)，吉富羅非魚細胞與小鼠淋巴細胞的熒光密度峰值相近，不易區(qū)分，如果對照品和測試樣品分別上機檢測即采用外標(biāo)法檢測時，有可能出現(xiàn)一定的誤差。許曉軍等報道采用內(nèi)標(biāo)法獲得的檢測結(jié)果變異系數(shù)小于外標(biāo)法，并建議選取DNA含量相差較大的物種作為參照標(biāo)準(zhǔn)[19]，因此本試驗選取小鼠淋巴細胞作為對照標(biāo)準(zhǔn)，以內(nèi)標(biāo)法測定吉富羅非魚的細胞核DNA含量。

參考文獻：

[1]楊 弘. 我國羅非魚產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)[J]. 中國水產(chǎn)，2010（9）：6-10.

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[18]黃永春，李文靜，林祥日，等. 星洲紅魚形態(tài)、染色體組型及細胞核DNA含量的分析[J]. 淡水漁業(yè)，2011，41（5）：3-8.

2.2 吉富羅非魚的細胞核DNA含量

采用流式細胞儀對吉富羅非魚的血細胞DNA含量進行了測定，詳見圖1、表1?？梢钥闯黾涣_非魚血細胞的平均熒光密度值為200.33±11.260 2，小鼠淋巴細胞的平均熒光密度值為590.50±28.302 9，兩者比值0.339 2±0.009 0。以小鼠淋巴細胞DNA的絕對含量值7.0 pg/2C作為標(biāo)準(zhǔn)，可以算出吉富羅非魚的血細胞DNA絕對含量為（2.374 5±0.063 0） pg/2C。

3 討論

研究魚類的種質(zhì)參數(shù)、掌握該魚的種質(zhì)特征對于人工育種都具有一定的指導(dǎo)意義。DNA含量分析是種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中不可缺少的參數(shù)之一。近年來測定魚類細胞DNA含量的方法主要是采用顯微分光光度計和流式細胞儀2種方法[11]，從目前的技術(shù)水平來看，采用流式細胞儀測定魚類DNA含量要比采用顯微分光光度計法更準(zhǔn)確些。流式細胞儀是70年代發(fā)展起來的一種利用流式細胞儀對細胞等生物粒子的理化及生物學(xué)特性（細胞大小、DNA/RNA、細胞表面抗原表達等）進行相關(guān)檢測分析的高技術(shù)儀器，具有快速、準(zhǔn)確、采集數(shù)據(jù)量大（速度可達1 000～10 000個/s）、分析全面和操作簡單等優(yōu)點，目前已廣泛運用于魚類、蝦類等DNA含量和倍性的檢測中[12-14]。到目前為止，用流式細胞儀測定魚類細胞含量的方法已比較完善和普遍。此外，流式細胞儀對樣品需求量少，只需要微量魚血即可，使得對試驗魚的傷害減至最低。

對于同一種生物而言，體細胞的DNA含量是恒定的，具有種的特征，在親緣關(guān)系相近的類群中可以作為探討其演化地位和親緣關(guān)系的依據(jù)[13]。吳洪喜等測定得毛蚶（Scapharca subcrenata Lischke）與魁蚶（Scapharca broughtonii Schrenck）的DNA含量高度一致，表明兩者之間的親緣關(guān)系接近，但泥蚶（Arca granosa）的DNA含量則稍高于毛蚶和魁蚶，因此認為泥蚶在進化程度上與毛蚶和魁蚶相近且比它們要高級[14]。方旅平等研究發(fā)現(xiàn)，日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）與刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）DNA含量的絕對值相差不大，因而推知這2種蝦在系統(tǒng)發(fā)生上具有相近的親緣關(guān)系，這與形態(tài)學(xué)上的分類系統(tǒng)是一致的[15]。顧若波等研究發(fā)現(xiàn)，似刺鳊（Paracanthobrama guichenoti Bleeker）的細胞核DNA含量與同亞科的花（Hemibarbus maculatus Bleeker）接近[16]。本試驗利用流式細胞術(shù)測得吉富羅非魚血細胞核DNA含量為（2.374 5±0.063 0）pg/2C，與已報道的尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的（2.27±0.07）pg/2C、奧利亞羅非魚（O. aureus）的（2.22±0.08）pg/2C[17]和星洲紅魚（Red Tilapia）的（2.46±0.09）pg/2C[18]相近，這與4種羅非魚親緣關(guān)系接近是一致的。

常見的參照標(biāo)準(zhǔn)有雞血細胞、人淋巴細胞、小鼠淋巴細胞、鱉血細胞、鱒魚紅細胞及鮭魚紅細胞等[11]。雞血細胞具有來源豐富、著色性好、大小均勻等優(yōu)點，并且在大量研究中被廣泛應(yīng)用，而且雞血細胞與羅非魚的DNA含量相近，比值接近[17]。采用內(nèi)標(biāo)法檢測發(fā)現(xiàn)，吉富羅非魚細胞與小鼠淋巴細胞的熒光密度峰值相近，不易區(qū)分，如果對照品和測試樣品分別上機檢測即采用外標(biāo)法檢測時，有可能出現(xiàn)一定的誤差。許曉軍等報道采用內(nèi)標(biāo)法獲得的檢測結(jié)果變異系數(shù)小于外標(biāo)法，并建議選取DNA含量相差較大的物種作為參照標(biāo)準(zhǔn)[19]，因此本試驗選取小鼠淋巴細胞作為對照標(biāo)準(zhǔn)，以內(nèi)標(biāo)法測定吉富羅非魚的細胞核DNA含量。

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[18]黃永春，李文靜，林祥日，等. 星洲紅魚形態(tài)、染色體組型及細胞核DNA含量的分析[J]. 淡水漁業(yè)，2011，41（5）：3-8.

2.2 吉富羅非魚的細胞核DNA含量

采用流式細胞儀對吉富羅非魚的血細胞DNA含量進行了測定，詳見圖1、表1?？梢钥闯黾涣_非魚血細胞的平均熒光密度值為200.33±11.260 2，小鼠淋巴細胞的平均熒光密度值為590.50±28.302 9，兩者比值0.339 2±0.009 0。以小鼠淋巴細胞DNA的絕對含量值7.0 pg/2C作為標(biāo)準(zhǔn)，可以算出吉富羅非魚的血細胞DNA絕對含量為（2.374 5±0.063 0） pg/2C。

3 討論

研究魚類的種質(zhì)參數(shù)、掌握該魚的種質(zhì)特征對于人工育種都具有一定的指導(dǎo)意義。DNA含量分析是種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中不可缺少的參數(shù)之一。近年來測定魚類細胞DNA含量的方法主要是采用顯微分光光度計和流式細胞儀2種方法[11]，從目前的技術(shù)水平來看，采用流式細胞儀測定魚類DNA含量要比采用顯微分光光度計法更準(zhǔn)確些。流式細胞儀是70年代發(fā)展起來的一種利用流式細胞儀對細胞等生物粒子的理化及生物學(xué)特性（細胞大小、DNA/RNA、細胞表面抗原表達等）進行相關(guān)檢測分析的高技術(shù)儀器，具有快速、準(zhǔn)確、采集數(shù)據(jù)量大（速度可達1 000～10 000個/s）、分析全面和操作簡單等優(yōu)點，目前已廣泛運用于魚類、蝦類等DNA含量和倍性的檢測中[12-14]。到目前為止，用流式細胞儀測定魚類細胞含量的方法已比較完善和普遍。此外，流式細胞儀對樣品需求量少，只需要微量魚血即可，使得對試驗魚的傷害減至最低。

對于同一種生物而言，體細胞的DNA含量是恒定的，具有種的特征，在親緣關(guān)系相近的類群中可以作為探討其演化地位和親緣關(guān)系的依據(jù)[13]。吳洪喜等測定得毛蚶（Scapharca subcrenata Lischke）與魁蚶（Scapharca broughtonii Schrenck）的DNA含量高度一致，表明兩者之間的親緣關(guān)系接近，但泥蚶（Arca granosa）的DNA含量則稍高于毛蚶和魁蚶，因此認為泥蚶在進化程度上與毛蚶和魁蚶相近且比它們要高級[14]。方旅平等研究發(fā)現(xiàn)，日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）與刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）DNA含量的絕對值相差不大，因而推知這2種蝦在系統(tǒng)發(fā)生上具有相近的親緣關(guān)系，這與形態(tài)學(xué)上的分類系統(tǒng)是一致的[15]。顧若波等研究發(fā)現(xiàn)，似刺鳊（Paracanthobrama guichenoti Bleeker）的細胞核DNA含量與同亞科的花（Hemibarbus maculatus Bleeker）接近[16]。本試驗利用流式細胞術(shù)測得吉富羅非魚血細胞核DNA含量為（2.374 5±0.063 0）pg/2C，與已報道的尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的（2.27±0.07）pg/2C、奧利亞羅非魚（O. aureus）的（2.22±0.08）pg/2C[17]和星洲紅魚（Red Tilapia）的（2.46±0.09）pg/2C[18]相近，這與4種羅非魚親緣關(guān)系接近是一致的。

常見的參照標(biāo)準(zhǔn)有雞血細胞、人淋巴細胞、小鼠淋巴細胞、鱉血細胞、鱒魚紅細胞及鮭魚紅細胞等[11]。雞血細胞具有來源豐富、著色性好、大小均勻等優(yōu)點，并且在大量研究中被廣泛應(yīng)用，而且雞血細胞與羅非魚的DNA含量相近，比值接近[17]。采用內(nèi)標(biāo)法檢測發(fā)現(xiàn)，吉富羅非魚細胞與小鼠淋巴細胞的熒光密度峰值相近，不易區(qū)分，如果對照品和測試樣品分別上機檢測即采用外標(biāo)法檢測時，有可能出現(xiàn)一定的誤差。許曉軍等報道采用內(nèi)標(biāo)法獲得的檢測結(jié)果變異系數(shù)小于外標(biāo)法，并建議選取DNA含量相差較大的物種作為參照標(biāo)準(zhǔn)[19]，因此本試驗選取小鼠淋巴細胞作為對照標(biāo)準(zhǔn)，以內(nèi)標(biāo)法測定吉富羅非魚的細胞核DNA含量。

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