胡傳水等

摘要：將抗凋亡試劑葛根素（0、0.02、0.10、0.50、2.50 mmol/L）、酒石酸美托洛爾（0、0.02、0.10、0.50、2.50 mmol/L）、二氯乙酸鈉（0、0.04、0.20、1.00、5.00 mmol/L）加入稀釋液中，探討它們?cè)谪i精液常溫保存中的效果。結(jié)果表明：0.50 mmol/L 葛根素可以延長(zhǎng)精子保存時(shí)間及存活指數(shù)（P<0.05）；0.50 mmol/L 酒石酸美托洛爾能降低精子畸形率（P<0.05）；5.00 mmol/L二氯乙酸鈉可以縮短精子存活時(shí)間和存活指數(shù)（P<0.05）。總之，合適濃度的葛根素或酒石酸美托洛爾可以顯著提高豬精液常溫保存后的品質(zhì)，而二氯乙酸鈉對(duì)豬精液常溫保存效果沒(méi)有明顯的改善作用。

關(guān)鍵詞：豬；精液；常溫保存；抗凋亡試劑

中圖分類號(hào)： S828.3+4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0138-03

隨著人工授精（AI）技術(shù)在現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)中發(fā)揮出更加巨大的作用，精液保存技術(shù)顯得日益重要，并愈加顯示出其在降低公豬飼養(yǎng)成本、提高經(jīng)濟(jì)效益、加快育種速度、防止疾病傳播等方面的優(yōu)勢(shì)[1]。與冷凍精液相比，常規(guī)液態(tài)保存精液具有設(shè)備要求低、操作過(guò)程簡(jiǎn)單、所需費(fèi)用低、繁殖成績(jī)好（受胎率、分娩率和窩產(chǎn)仔數(shù)較高）等優(yōu)點(diǎn)[2]，所以，在豬人工授精技術(shù)中以使用常溫精液為主，占到使用精液總量的99%[3]。因此，豬精液常溫液態(tài)保存的研究對(duì)豬人工授精技術(shù)的發(fā)展乃至養(yǎng)豬生產(chǎn)具有很高的實(shí)用價(jià)值。相關(guān)的文獻(xiàn)[4-10]認(rèn)為，人和動(dòng)物精液射出體外之后，各種理化條件均會(huì)促進(jìn)精子發(fā)生凋亡，而葛根素（Pur）、酒石酸美托洛爾（MTA）及二氯乙酸鈉（DCA）3種試劑可以抑制胞漿內(nèi)游離Ca2+濃度的持續(xù)性升高，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生[11-14]；但是，迄今為止未見這3種試劑在豬精液保存方面的應(yīng)用報(bào)道。因此，本試驗(yàn)探討Pur、MTA及DCA在豬精液常溫保存中的效果，為豬精液常溫保存稀釋液配方的改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備及試劑

Haier藥品保存箱（深圳市凱銘杰儀器設(shè)備有限公司），電子恒溫水浴鍋（廣州市富家電器廠），相差顯微鏡（OLYMPUS CH3_DO 6M01434），電子冷暖箱（北京福意聯(lián)電器有限公司），DJ-200電子天平（北京宏宇振興科貿(mào)有限公司）。乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），N-乙酰半胱氨酸（NAC）、Pur、MTA（阿拉丁試劑上海公司），DCA（西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司），苯胺藍(lán)（天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心），龍膽紫（天機(jī)博迪化工公司）。

1.2 精液的采集與處理

采用手握法采集健康、正常采精的長(zhǎng)白、約克和杜洛克種公豬（飼養(yǎng)于廣西科達(dá)畜禽改良有限責(zé)任公司）中段精子濃密精液，用4層脫脂紗布過(guò)濾去除膠狀物，原精精子活力0.7以上，氣味、色澤正常者供稀釋保存用。

1.3 精液的稀釋與保存

按配方準(zhǔn)確配制稀釋液，37 ℃等溫條件下按1 ∶ 2的比例稀釋，用紗布包裹后保存在16～18 ℃的常溫環(huán)境中。

1.4 精液品質(zhì)檢查

1.4.1 精子存活時(shí)間 每隔一定時(shí)間檢查活力，直到精子全部死亡為止。記錄精子有效存活時(shí)間（精子活力為0.4的保存時(shí)間）、總存活時(shí)間（精子全部死亡的保存時(shí)間），并計(jì)算精子存活指數(shù){∑[（上次活力+下次活力）/2×?xí)r間間隔]}。

1.4.2 精子的畸形率、頂體完整率 于保存72 h時(shí)進(jìn)行檢查，具體步驟為：精液涂片→干燥→10%福爾馬林生理鹽水固定15 s→水洗→5%苯胺藍(lán)溶液染色15～20 s→水洗→0.5%龍膽紫水溶液染色4～6 s→水洗→干燥→鏡檢。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

添加3種試劑的試驗(yàn)均分為5個(gè)組，對(duì)照組的稀釋液為常用的葡萄糖-檸檬酸鈉-EDTA液（葡萄糖3.71%，檸檬酸鈉0.53%，碳酸氫鈉0.13%，NAC 0.02%，EDTA 0.13%，KCl 0.08%，青霉素0.06%，鏈霉素0.10%）[15]，試驗(yàn)組1～4的稀釋液在對(duì)照組的基礎(chǔ)上分別添加0.02、0.10、0.50、2.50 mmol/L 的Pur或MTA，或0.04、0.20、1.00、5.00 mmol/L的DCA。所有試驗(yàn)均重復(fù)6次。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得的各組數(shù)據(jù)均以“x±s”表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)各組之間差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pur在豬精液常溫保存中的應(yīng)用效果

如表1所示，從稀釋后活力、頂體完整率及畸形率來(lái)看，添加Pur的各個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異不顯著（P>0.05）。在有效存活時(shí)間、總存活時(shí)間及存活指數(shù)方面，添加0.50 mmol/L Pur的試驗(yàn)組顯著高于其他各組（P<005）。結(jié)果表明，在本試驗(yàn)條件下，0.50 mmol/L 是Pur在豬精液常溫保存稀釋液中的最佳添加濃度。

3 討論

3.1 Pur對(duì)豬精液常溫保存效果的影響

Pur為豆科葛屬植物野葛及甘葛藤根異黃酮中的主要有效成分[16]，由于具有鈣離子拮抗和抗凋亡等多種藥理作用[11-12]而得到廣泛的臨床應(yīng)用，特別是在心腦血管等疾病的治療[17]方面，近年來(lái)深受學(xué)者們的關(guān)注和重視，進(jìn)行了大量的研究工作，取得了許多重要的研究進(jìn)展。大量研究表明，在被各種因素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡出現(xiàn)之前，胞漿內(nèi)游離Ca2+的濃度均持續(xù)性升高，抑制其升高則可阻止誘導(dǎo)的細(xì)胞發(fā)生凋亡。中山大學(xué)眼科中心發(fā)現(xiàn)Pur藥物治療可延緩視網(wǎng)膜脫離rd小鼠視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞層數(shù)或密度的減少，延緩?fù)舛伪P膜部位的線粒體、盤膜以及外界膜的破壞，明顯降低7、14、21、28和35 d時(shí)rd小鼠視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的凋亡率，同時(shí)增強(qiáng)rd小鼠視網(wǎng)膜外核層間質(zhì)及其光感受器細(xì)胞外段Bcl-2的表達(dá)[18]。Pur不僅具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管，抑制血小板聚集，提高心肌細(xì)胞耐缺血、缺氧的能力[19]，而且能抑制茶酚胺誘導(dǎo)的心肌損傷過(guò)程中FSA蛋白的表達(dá)，影響心肌細(xì)胞的凋亡，產(chǎn)生對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用[20]。研究還發(fā)現(xiàn)，Pur可保護(hù)由于高壓引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其主要原因可能與Pur的抗氧化、鈣離子拮抗和β受體阻滯等作用有關(guān)[21-22]。Pur對(duì)缺血再灌注損傷導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其機(jī)理主要是由于灌注后胞內(nèi)鈣離子、氧自由基增多導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在缺血再灌注前后，Bcl-2蛋白表達(dá)量發(fā)生改變，這是機(jī)體對(duì)抗凋亡的一種反應(yīng)。Pur對(duì)氧自由基有清除作用，并能預(yù)防對(duì)抗各種氧化劑誘導(dǎo)引起的氧化性損傷[23]。通過(guò)試驗(yàn)可見，在常溫稀釋液中添加 0.5 mmol/L 的Pur對(duì)改善豬精子的有效存活時(shí)間、總存活時(shí)間及存活指數(shù)均有良好效果，這可能與Pur增強(qiáng)了長(zhǎng)壽基因即Bcl-2的表達(dá)、鈣離子拮抗、β受體阻滯并發(fā)揮了抗氧化作用有關(guān)，而 2.5 mmol/L Pur會(huì)顯著縮短豬精子存活時(shí)間，這說(shuō)明Pur需要在一定濃度范圍內(nèi)才能發(fā)揮對(duì)精子的保護(hù)作用。endprint

3.2 MTA對(duì)豬精液常溫保存效果的影響

MTA屬抗心律失常/抗高血壓類藥，為2A類即無(wú)部分激動(dòng)活性的β1-受體阻斷藥（心臟選擇性β-受體阻斷藥），除了藥效學(xué)上具有β-受體阻滯劑的優(yōu)點(diǎn)外，還可抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、減輕鈣負(fù)荷及清除氧自由基[13，24]。該藥品臨床應(yīng)用多年，能有效治療高血壓、心絞痛、心肌梗塞、心律失常和慢性心力衰竭等心血管方面的疾病[25-27]。陳躍峰等的研究表明，MTA能減少急性心肌梗死、邊緣區(qū)和非梗死區(qū)的心肌細(xì)胞凋亡，它主要是通過(guò)增加Bcl-2的表達(dá)和抑制促細(xì)胞凋亡蛋白合成來(lái)實(shí)現(xiàn)這一功能[28]。趙梅等的研究結(jié)果表明，MTA能減少Fas和NF-KB蛋白的表達(dá)，而且大劑量的MTA干預(yù)對(duì)Fas和NF-KB的影響效果大于小劑量MTA，提示MTA的抗心肌細(xì)胞凋亡率取決于它對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)影響程度的差異和β-受體的阻斷作用[29]。本試驗(yàn)在豬精液常溫稀釋液中添加不同濃度的MTA，結(jié)果顯示0.02、2.50 mmol/L MTA能夠提高精子稀釋后活力，0.50 mmol/L MTA能降低精子畸形率，這可能是MTA減輕鈣負(fù)荷、清除氧自由基、增加Bcl-2的表達(dá)和抑制促細(xì)胞凋亡蛋白合成，從而阻斷了細(xì)胞凋亡的緣故。

3.3 DCA對(duì)豬精液常溫保存效果的影響

DCA是一種多用于治療乳酸酸中毒的小分子藥物，近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，它可以通過(guò)促進(jìn)乳酸氧化、降低血液乳酸水平、改善機(jī)體的代謝平衡來(lái)治療一些代謝性疾病，如先天性或代償性乳酸酸中毒。在組織缺氧情況下，激烈運(yùn)動(dòng)會(huì)造成組織缺氧及高乳酸水平，DCA可通過(guò)增加氧攝取、激活丙酮酸脫氫酶復(fù)合物、促進(jìn)乳酸氧化來(lái)補(bǔ)充能量供應(yīng)，從而改善缺氧組織的能量代謝狀況[30]。何作云等的研究顯示，01、1、10 mmol/L DCA均能顯著降低缺氧后復(fù)氧的心肌細(xì)胞的凋亡率[14]。鑒于上述試驗(yàn)基礎(chǔ)，本試驗(yàn)把DCA添加到常溫稀釋液中看是否對(duì)豬精子同樣具有抗凋亡作用，結(jié)果表明，添加 5.00 mmol/L DCA降低了精子的存活時(shí)間和存活指數(shù)，而其他劑量DCA效果不顯著；0.04、0.20、1.00 mmol/L DCA 對(duì)豬精液常溫保存無(wú)顯著影響，其機(jī)制可能是與這些濃度下DCA不能有效改善精子的能量代謝狀況或降低精子的凋亡率有關(guān)；5.00 mmol/L DCA可以顯著降低精子的存活時(shí)間和存活指數(shù)。與學(xué)者們針對(duì)乳腺癌[31]、子宮內(nèi)膜癌[32]、前列腺癌細(xì)胞[33]的研究結(jié)果類似，他們?cè)贒CA濃度為5 mmol/L 左右時(shí)即檢測(cè)到了對(duì)細(xì)胞明顯的增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用。因此，DCA在較低濃度時(shí)對(duì)精子可能有改善能量代謝狀況及降低凋亡率的作用，而在較高濃度時(shí)反而會(huì)有誘導(dǎo)凋亡的作用，其在豬精液常溫保存的適宜濃度有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，合適濃度的Pur或MTA可以顯著提高豬精液常溫保存后的品質(zhì)，而DCA對(duì)豬精液常溫保存效果沒(méi)有明顯的改善作用。

致謝：廣西畜禽品種改良站吳柱月研究員，韋干顯獸醫(yī)師，劉德玉、李芳芳、王英群、鄧祝新畜牧師；廣西科達(dá)畜禽改良有限責(zé)任公司彭夏云、韋永強(qiáng)、韋詩(shī)祥技術(shù)員；廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)專業(yè)2009級(jí)周文婷同學(xué)，在試驗(yàn)中給予幫助，特致謝忱。

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