彭琳 張浩 徐果

·實驗研究·

冬蟲夏草對糖尿病大鼠腎組織 ED-1及CoⅣ表達的影響

彭琳 張浩 徐果

目的 鏈脲佐菌素 (STZ)誘導建立單側(cè)腎切除糖尿病大鼠模型后 , 用蟲草菌粉 (Cs-4)對其進行干預治療 , 動態(tài)觀察腎間質(zhì)巨噬細胞 (ED-1)、Ⅳ型膠原 (Co Ⅳ )在大鼠腎組織中的表達 , 探討 Cs-4減輕糖尿病大鼠腎組織纖維化的作用機制。方法 36 只雄性 SD 大鼠隨機分為正常對照組、糖尿病模型組和 Cs-4 治療組 , 每組 12 只 , 于 4 周、12 周末查 24 h 尿蛋白定量 , 并 Masson 染色觀察腎臟病理變化及免疫組織化學染色觀察 ED-1、Co Ⅳ在腎組織中的表達。結(jié)果 Cs-4 組 24 h 尿蛋白定量低于模型組 , ED-1 的表達與相應模型組比均顯著降低 , Co Ⅳ的表達與相應模型組比均顯著降低 (P＜0.05)。結(jié)論 Cs-4對糖尿病大鼠腎組織具有一定的保護作用 , 其作用機制可能與減少炎癥細胞 (單核 /巨噬細胞 )在腎組織中的浸潤 , 在早期抑制腎組織炎癥反應 , 減輕腎臟細胞外基質(zhì)的積聚有關(guān)。

糖尿病；冬蟲夏草 ；腎間質(zhì)巨噬細胞 ；Ⅳ型膠原

糖尿病腎病 (diabetic nephropathy, DN)是糖尿病導致終末期腎病 (ESRD)［1］, 也是糖尿病患者死亡的主要原因之一。其發(fā)病機制十分復雜 , 包括長期高血糖、血流動力學改變、血脂異常等 , 但最近研究也發(fā)現(xiàn)腎內(nèi)炎癥狀態(tài)也是糖尿病腎病發(fā)生及進展的一個重要因素 , 其中炎細胞早期浸潤是其重要特點。冬蟲夏草 (cordyceps sinensis)為真菌寄生昆蟲復合體［2］,蟲草 Cs-4 菌株培養(yǎng)成蟲草菌粉 (Cs-4), 含天然蟲草多種活性成分。本研究用 Cs-4 早期干預糖尿病腎病大鼠 , 探討 Cs-4對糖尿病大鼠腎臟保護機制。

1 材料與方法

1. 1 動物模型 健康雄性 (Sprague-Dawley , SD)大鼠 36 只(由湘雅實驗動物中心提供 ), 體重 180~220 g, 6 周齡 , 無菌術(shù)條件下右腎摘除后隨機分組：正常對照組、糖尿病模型組及Cs-4 治療組。模型組、Cs-4 組腹腔注射 STZ 60 mg/kg, 72 h后測血糖確定建立糖尿病模型 , 正常組等量枸櫞酸鹽緩沖液。Cs-4 組 Cs-4 1.5 g/(kg·d) 灌胃 , 正常組、模型組等量蒸餾水。干預 4 周、14 周分別處死各組 6 只 , 處死前 1 d 收集 24 h 尿測尿蛋白。

1. 2 免疫組化 4 μm 腎石蠟切片 , 羊血清封閉加一抗 37℃孵化 1 h, 加二抗 37 ℃孵化 30 min, 加 SABC 37℃ 20 min, 顯微鏡下 DAB 顯色蘇木紫復染 , 同時 PBS 陰性對照。評分標準：計算每個視野 ED-1 陽性細胞。

1. 3 材料來源 蟲草菌粉購自杭州中美華東制藥有限公司 , ED-1、IV 型膠原 (type Ⅳ collage, Co Ⅳ )抗體購自武漢proteintech 公司 , PV6000 免疫組化試劑盒購自北京中杉公司 , TRIzol購自美國 Invitrogen 公司 , 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國美國Fermentas 公司 , TaqDNA 聚合酶購自美國 Thermo 公司 , 引物由上海生物工程有限公司合成。

1. 4 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS11.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理 ,計量資料以均數(shù) ± 標準差 ( x-±s)表示 , 采用 t檢驗 ；計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2. 1 24 h 尿蛋白變化 4 周、14 周檢測大鼠 24 h 尿蛋白量 ,提示模型組及 Cs-4 組達 DN 標準 (24 h 尿蛋白 >30 mg)時間依賴性增高 , Cs-4 組尿蛋白較模型組明顯減少 , 差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05), 見表1。

表1 三組大鼠 24 h 尿蛋白量

表1 三組大鼠 24 h 尿蛋白量

組別 數(shù)量 4周 1 4周對照組 1 2 2 5 . 8 2 ± 2 . 5 2 5 0 . 6 8 ± 9 . 5 5模型組 1 2 2 3 9 . 9 0 ± 9 . 1 2a 1 0 6 8 . 4 8 ± 6 0 . 7 8a治療組 1 2 2 0 5 . 2 4 ± 1 9 . 3 4ab 7 2 0 . 1 2 ± 5 6 . 4 5ac

注 ：與對照組比較 ,aP＜0.01 ；與模型組比較 ,bP＜0.05,cP＜0.01

2. 2 免疫組化 4 周、14 周檢測大鼠 ED-1 陽細胞浸潤腎小球內(nèi)、腎小球周圍及腎小管間質(zhì) , 模型組上述部位浸潤明顯高于對照組 , 差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01), 治療組明顯低于模型組 , 差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。4 周、14 周檢測大鼠 IV 型膠原呈線形分布在腎小球毛細血管基底膜及腎小管基底膜 , 模型組明顯高于對照組 , 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。治療組較模型組明顯減少 , 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05), 見表2。

表2 三組大鼠腎組織 ED-1 陽性細胞、腎間質(zhì) IV 型膠原蛋白 PI值結(jié)果

表2 三組大鼠腎組織 ED-1 陽性細胞、腎間質(zhì) IV 型膠原蛋白 PI值結(jié)果

注 ：與對照組比較 ,aP＜0.01,cP＜0.01 ；與模型組比較bP＜0.05,dP＜0.05

組別 數(shù)量 E D -1 陽性細胞I V 型膠原蛋白4 周 1 4 周 4 周 1 4 周對照組模型組治療組0 . 9 2 ± 0 . 1 2 1 7 . 6 2 ± 0 . 3 2c1 4 . 5 6 ± 1 . 8 0d1 2 1 2 1 2 0 . 1 5 ± 0 . 1 0 0 . 2 5 ± 0 . 0 2a0 . 1 7 ± 0 . 1 2b0 . 1 7 ± 0 . 1 1 0 . 3 2 ± 0 . 0 4a0 . 2 5 ± 0 . 0 3b0 . 7 9 ± 0 . 1 8 4 . 3 1 ± 0 . 6 2c2 . 7 2 ± 0 . 4 3d

3 討論

在多種免疫和非免疫介導的腎臟疾病轉(zhuǎn)歸過程中 , 慢性腎功能衰竭往往是其最終結(jié)局 , 而腎間質(zhì)纖維化則幾乎是所有腎臟疾病發(fā)展至終末期腎功能不全的共同通路 , 同時 , 有研究發(fā)現(xiàn)腎臟組織的微炎癥狀態(tài)也發(fā)揮著重要的作用。腎間質(zhì)纖維化的病理基礎(chǔ)主要表現(xiàn)為多種細胞外基質(zhì) (ECM)成分的積聚。腎臟組織的微炎癥狀態(tài)中腎臟固有細胞增殖、炎性細胞浸潤、局部炎癥介質(zhì)過度生成是腎間質(zhì)纖維化重要始動因素［3］。

糖尿病 (DM)發(fā)生率在我國明顯升高 , DN 特征性病理變化是腎間質(zhì)纖維化表現(xiàn)巨噬細胞浸潤［4,5］。巨噬細胞進入腎組織后 , 分泌促纖維化因子作用于小管間質(zhì)細胞 , 使其分化為肌成纖維細胞導致細胞外基質(zhì)增多 , 加重腎臟纖維化。細胞外基質(zhì)有膠原 , 膠原中最主要的是Ⅳ。近年來 , 在腎臟纖維化進展中 , 觀察到在腎組織中存在單核 /巨噬細胞浸潤 ,該炎癥細胞的作用也日益受到重視。既往對糖尿病腎病的研究認為血流動力學異常、血管病變、血糖代謝及血脂異常等參與了疾病的發(fā)展。但近年來的研究提示 , 在 DN 發(fā)生和進展中 , 炎癥細胞的浸潤及其引起促纖維化因子的生成也在腎臟病變中起一定的作用。

冬蟲夏草 (cordyceps sinensis, CS), 簡稱蟲草 , 是一種名貴中藥?，F(xiàn)代藥理學證明 , 蟲草含多種氨基酸 , 有抑菌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒等多種作用 , 蟲草菌粉 (Cs-4)是天然冬蟲夏草的 Cs-4 菌株培養(yǎng)而成 , 與天然冬蟲夏草一樣含有多種活性成分 , 具有雙向調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗衰老及抗炎癥等多種效應 , 本研究通過用 Cs-4 干預糖尿病腎病大鼠 , 觀察早期單核 /巨噬細胞表面特異性標志抗原 (ectodermal dysplasia 1)在腎臟組織中的浸潤情況 , 及后期對腎臟細胞外基質(zhì)積聚的影響 , 探討 Cs-4 對糖尿病大鼠的腎臟保護機制可能為抑制腎內(nèi)炎癥細胞浸潤 , 而非血糖、血脂及血流動力學作用。

蟲草抑減輕炎癥細胞浸潤 , 減輕腎臟纖維化 , 對模型大鼠腎小球肥大有明顯減輕作用 , 并能明顯減輕腎組織炎癥［6］。由于天然蟲草的藥缺價高 , 限制了天然蟲草的研究與應用。蟲草研究中 , 有多種成熟人工制劑 , 常用的有百令膠囊 , 堿提液 , 蟲草腎康膠囊等。經(jīng)藥理研究 , 以上人工制劑成份與天然冬蟲夏草基本一致［7］。隨著人工蟲草彌補了天然蟲草的藥源不足 , 蟲草的實驗研究與臨床應用更加深入［8］。本實驗所用蟲草菌粉 (Cs-4), 即是天然冬蟲夏草的 Cs-4 菌株培養(yǎng)而成 , 具有與其相同的成分與作用。本研究發(fā)現(xiàn) Cs-4 干預DN 大鼠 4 周、14 周后 , ED-1 陽細胞浸潤較模型組顯著降低(P＜0.05), Ⅳ型膠原表達較模型組明顯減少。通過本實驗推測Cs-4 可通過抑制單核 /巨噬細胞在糖尿病大鼠腎組織中的浸潤 , 抑制腎組織早期炎癥反應。

［1］王玉成 . 蟲草在糖尿病及糖尿病腎病治療中的研究進展 . 時珍國醫(yī)國藥 , 2004, 15(10):700-701.

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［3］ Navarro JF, Mora C, Macia M, et al. Inflammatory parameters are independently associated with urinary albumin in type 2 diabeties mellitus. Am J Kindey Dis, 2003, 42(1):53-55.

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［8］ Noronha IL, Fujihara CK, Zatz R. The inflammatory component in progressive renal disease are interventions possible. Nephrol Dial Transplant, 2002, 17(3):363-368.

2014-05-08］

410005 長沙市第一醫(yī)院 (彭琳 )；中南大學湘雅三醫(yī)院腎內(nèi)科（張浩 徐果）