宋海峰，劉 濤，張衍國

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院皮膚科，陜西西安 710038)

◇技術(shù)方法研究◇

瘢痕疙瘩間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)及其生長曲線的研究

宋海峰，劉 濤，張衍國

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院皮膚科，陜西西安 710038)

目的 探索獲得瘢痕疙瘩來源的高純度間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的培養(yǎng)方法。方法 來源于第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院皮膚科住院的4例患者的瘢痕疙瘩標(biāo)本，所取病變部位均位于前胸及后背皮膚，采用DMEM∶F12/(100 mL/L)胎牛血清(FBS)初步培養(yǎng)，再改用低糖DMEM/(100 mL/L)FBS培養(yǎng)，接著用低糖DMEM/(10 mL/L)FBS培養(yǎng)，最后用無血清的干細(xì)胞培養(yǎng)基(SCM)培養(yǎng)，并通過觀察細(xì)胞形態(tài)特征及應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)情況進(jìn)行鑒定。結(jié)果 經(jīng)血清梯度培養(yǎng)后得到了長梭形、形態(tài)均一，純度較高的纖維樣細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測后細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)情況為：CD29為99.99%，CD44為99.7%，CD45為0.69%，CD73為99.96%。結(jié)論 血清濃度逐漸降低的梯度培養(yǎng)法可獲得高純度的瘢痕疙瘩MSCs。

瘢痕疙瘩；間充質(zhì)干細(xì)胞；CD29；CD44；CD45；CD73；細(xì)胞生長曲線

瘢痕分為生理性瘢痕和病理性瘢痕，而病理性瘢痕又分為增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。瘢痕疙瘩主要由局部創(chuàng)傷和表皮異位等造成真皮損失和膠原的異常聚集所致，在臨床上表現(xiàn)為呈“蟹足樣”浸潤性生長[1]。一般不自行萎縮，切除后易于復(fù)發(fā)，但一般不會發(fā)生轉(zhuǎn)移和惡變[2]。目前瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制不清，也無理想的治療方法[3]。而間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是來源于早期中胚層的一類多能干細(xì)胞，目前已經(jīng)從骨髓、骨膜、皮膚等組織處分離得到MSCs[4]。有報道表明，瘢痕疙瘩中MSCs的數(shù)量要比正常皮膚中的多[5]，但是其作用機(jī)制尚不明確。因此，對MSCs的研究成為瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制研究的一個重要方面。目前對于瘢痕疙瘩MSCs的分離培養(yǎng)一般借鑒正常皮膚MSCs的培養(yǎng)方法，但一般培養(yǎng)周期長，和成纖維細(xì)胞呈混雜生長，難以分離出純度高的干細(xì)胞。因此，探討瘢痕疙瘩MSCs的培養(yǎng)方法對瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制的研究具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 瘢痕疙瘩標(biāo)本來源于第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院皮膚科住院的4例患者，患者均為初次就診，此前未接受過其他治療，無全身其他器質(zhì)性疾病，病變部位均位于前胸及后背。經(jīng)患者知情同意后，以手術(shù)及電子線照射治療瘢痕疙瘩病變，同時經(jīng)病理診斷確診為瘢痕疙瘩，留取標(biāo)本備用。

1.2 主要試劑及儀器 2.5 g/L胰蛋白酶(Hyclon)，胎牛血清(FBS，Gibco)，干細(xì)胞培養(yǎng)基(Cell Therapy Systems STEMPRO MSC SFM CTSTM, Gibco)，Ⅱ型中性蛋白酶(Dispase Ⅱ, Roche)，CD29-PerCP、CD44-FITC、CD45-PE、CD73-APC(eBioScience)，CO2恒溫培養(yǎng)箱( 美國Thermo公司)，高速低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)。

1.3 MSCs原代分離 用生理鹽水將瘢痕疙瘩標(biāo)本帶回實驗室，并用生理鹽水涮洗3次，采用RIEKSTINA等[6]報道的正常皮膚MSCs的分離方法，將瘢痕疙瘩組織塊剪成條索狀，用25 g/L Ⅱ型中性蛋白酶37 ℃孵育2 h，在無菌條件下用鑷子輕輕撕去表皮，留下真皮。再將樣本剪成1 mm3大小的組織塊，D-Hanks緩沖液洗3次，2.5 g/L胰蛋白酶37 ℃消化15 min，加入含有100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，用吸管反復(fù)吹打乳糜狀組織塊使細(xì)胞分離，通過孔徑40 μm的細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，濾液離心棄上清，加入含100 mL/L FBS和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM∶F12(1∶1)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 MSCs的培養(yǎng)及顯微鏡下的形態(tài)觀察 采用CARLSON等[7]關(guān)于小鼠心肌MSCs的培養(yǎng)方法，用含100 mL/L FBS和1%雙抗的DMEM∶F12(1∶1)培養(yǎng)基于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，37 ℃、50 mL/L CO2條件下孵箱，10 d后改為含100 mL/L FBS的低糖DMEM的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，使MSC富集；再改用含10 mL/L FBS的低糖DMEM的培養(yǎng)基培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，直到長梭形的細(xì)胞成為優(yōu)勢細(xì)胞；最后用含1 g/L的poly-D-賴氨酸的無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基(SCM)培養(yǎng)細(xì)胞[含低糖DMEM∶Ham’s F12(1∶1)、B27、抗生素、20 ng/mL EGF、10 ng/mL FGF-2、10 ng/mL LIF]，直到細(xì)胞完全融合后胰酶消化傳代。

1.5 MSCs表面標(biāo)志的鑒定 取第3代貼壁細(xì)胞，胰蛋白酶37 ℃消化2 min，用含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心、棄上清液，加入PBS制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL，PBS洗滌、離心后加入95 μL的PBS重新懸浮細(xì)胞，分別滴加5 μL的CD29-PerCP、CD44-FITC、CD45-PE和CD73-APC 4種熒光抗體，冰上避光孵育30 min，以1 000 r/min離心5 min，棄去含熒光抗體的PBS，再用PBS洗滌2次，除去未結(jié)合的熒光抗體。向細(xì)胞中加入500 μL預(yù)冷的PBS，吹打混勻，轉(zhuǎn)移至流式管中，同時以未被抗體處理的MSCs作為陰性對照，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.6 觀察MSCs生長并繪制生長曲線 取第3代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個/mL，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后第1、2、3、4、5、6、7、8 d采用錐蟲藍(lán)染色，計數(shù)活細(xì)胞并繪制生長曲線。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學(xué)特性 原代分離培養(yǎng)的細(xì)胞初期大部分為小圓形細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后大部分細(xì)胞死亡，只有少量細(xì)胞存活，且生長繁殖速度緩慢。細(xì)胞在經(jīng)過1～2周的潛伏期后，細(xì)胞數(shù)迅速增多，形態(tài)呈梭形，放射狀生長，倒置顯微鏡下可見多個細(xì)胞克隆，繼續(xù)培養(yǎng)后細(xì)胞逐漸融合在一起，早期貼壁的細(xì)胞形態(tài)差異較大，有橢圓形、多角形和梭形等(圖1A)。隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞形態(tài)逐漸變得均一，以長梭形為主。原代培養(yǎng)8～10 d后，改用低糖DMEM/(100 mL/L)得FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)3～4 d培養(yǎng)后，細(xì)胞逐漸變的細(xì)長，分裂速度明顯加快(圖1B)。再改用低糖DMEM/(10 mL/L)FBS培養(yǎng)后，細(xì)胞形態(tài)變得更加均一，增殖速度更快，2～3 d就可以增殖2倍以上(圖1C)。后改用無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞趨于穩(wěn)定，為研究MSCs的各種生物學(xué)特性的最佳時期(圖1D)。

2.2 細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)記物的檢測 MSCs高表達(dá)CD29、CD44、CD73，低表達(dá)或不表達(dá)CD45，第3代細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)的比例：CD29為99.99%，CD44為99.7%，CD45為0.69%，CD73為99.96%(圖2)。

圖1 血清濃度逐步降低培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)

Fig.1 Cell morphology under cultured conditions of gradually decreased serum concentration (×100)

A：DMEM∶F12/(100 mL/L)FBS原代分離的細(xì)胞形態(tài)(8 d)；B：低糖DMEM/(100 mL/L)FBS刺激后的細(xì)胞形態(tài)(14 d)；C：低糖DMEM/(10 mL/L)FBS刺激后的細(xì)胞形態(tài)(17 d)；D：無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞形態(tài)(19 d)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測瘢痕疙瘩MSCs表面標(biāo)志物的結(jié)果

Fig.2 Results of keloid-derived MSCs surface markers detected by flow cytometry method

2.3 細(xì)胞生長曲線的繪制及特點 第3代細(xì)胞生長曲線結(jié)果顯示，最初的2 d細(xì)胞生長緩慢，但從第3天開始細(xì)胞數(shù)量明顯增加，呈現(xiàn)對數(shù)生長，第7～8天以后細(xì)胞增殖變緩,形成一個平臺期(圖3)。

圖3 瘢痕疙瘩MSCs的生長曲線

Fig.3 Growth curve of keloid-derived MSCs

3 討 論

近年來國內(nèi)外學(xué)者對瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了深入研究，但其發(fā)病的實質(zhì)仍未闡明，對MSCs的研究已成為瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制研究的一個重要方向。IQBAL等[8]對瘢痕疙瘩皮損內(nèi)和皮損外造血干細(xì)胞(haematopoietic stem cells, HSCs)和MSCs分布的研究發(fā)現(xiàn)，CD13+、CD29+、CD44+ 和CD90+的MSCs主要分布于皮損內(nèi)，而CD34+、CD90+和CD117+的HSCs主要分布于皮損外。同時發(fā)現(xiàn)，在皮損內(nèi)外還含有獨特的CD34+細(xì)胞，這提示瘢痕疙瘩為非造血干細(xì)胞提供了適宜的生長環(huán)境。AKINO等[9]研究發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩來源的成纖維細(xì)胞能夠誘導(dǎo)人MSCs向肌成纖維母細(xì)胞方向分化，這是終末分化成熟的成纖維細(xì)胞所不具備的屬性，而具有分化潛能的MSCs可能在瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

迄今為止，體外分離培養(yǎng)MSCs還沒有統(tǒng)一的方案，目前瘢痕疙瘩MSCs的分離主要借鑒正常皮膚MSCs的分離方法[6,10]。國內(nèi)外一些學(xué)者也從瘢痕疙瘩中分離出了MSCs[11]，但是分離的干細(xì)胞純度不高，混有成纖維細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞，給進(jìn)一步研究的結(jié)果判斷帶來一定的干擾，因此分離高純度的MSCs成為瘢痕疙瘩研究應(yīng)首要解決的問題。

瘢痕疙瘩組織由于含有大量的膠原纖維，其質(zhì)地比正常皮膚堅硬，在分離細(xì)胞時，首先將瘢痕疙瘩剪成小組織塊的過程比正常皮膚要困難，需要細(xì)心和技巧，同時用胰酶消化的時間要進(jìn)行摸索，消化時間過短，細(xì)胞分離不出來，消化時間過長，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，無法貼壁。本實驗經(jīng)過探索選用2.5 g/L的胰蛋白酶37 ℃消化15 min后加含血清的培養(yǎng)液終止消化，可以達(dá)到較理想的效果。在細(xì)胞的后續(xù)培養(yǎng)中借鑒CARLSON[7]等關(guān)于小鼠心肌MSCs的培養(yǎng)方法，先用DMEM∶F12/(100 mL/L)FBS初步培養(yǎng)，再改用低糖DMEM/(100 mL/L)FBS培養(yǎng)，接著用低糖DMEM/(10 mL/L)FBS培養(yǎng)，最后用無血清的干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。這種逐步降低血清濃度，形成血清的濃度梯度，在最初的培養(yǎng)中高濃度的血清有助于細(xì)胞貼壁和快速增殖，而隨著血清濃度的降低，直至無血清培養(yǎng)，不但干細(xì)胞的分化受到抑制，而且可能由于缺乏某些營養(yǎng)成分，雜細(xì)胞的生長也得到抑制，從而得到高純度的MSCs。此外，無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞因子B27和FGF-2為MSCs生長所必須，而EGF和LIF則為非必須因子[6]。因此，無血清干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中需加入含B27和FGF-2等因子的添加劑。瘢痕疙瘩MSCs在培養(yǎng)過程中特別容易污染，因此預(yù)防細(xì)胞污染對干細(xì)胞能否培養(yǎng)成功尤為重要。在實驗過程中給干細(xì)胞培養(yǎng)基添加青霉素和鏈霉素，同時及時換液和傳代，注意操作過程中的細(xì)節(jié)，比如在培養(yǎng)細(xì)胞時將手進(jìn)行徹底消毒，禁止說話等可防止細(xì)胞污染。

對于MSCs的鑒定目前也沒有統(tǒng)一的方法，迄今為止也沒有篩選到用于鑒定MSCs的特異標(biāo)記分子，也沒有統(tǒng)一的命名[12-13]，但不同來源的MSCs卻有一些共同的標(biāo)準(zhǔn)，如CD13、CD29、CD44、CD73、CD105和CD166陽性，CD11a、CD14、CD34和CD45陰性[14-16]。本實驗也采用多個表面標(biāo)志組合進(jìn)行鑒定，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)鑒定的結(jié)果表明瘢痕疙瘩來源的第3代纖維樣細(xì)胞均高表達(dá)CD29、CD44和CD73等MSCs表面標(biāo)記物，低表達(dá)CD45等造血干細(xì)胞表面標(biāo)記物。MSCs具有向成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞等多向分化的能力，誘導(dǎo)分化實驗雖然能夠研究MSCs的多向分化潛能，但是不能提示細(xì)胞的純度。因此，我們直接用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞純度。同時細(xì)胞生長曲線分析表明，MSCs在最初2 d為生長緩慢的潛伏期，隨后細(xì)胞生長速度加快進(jìn)入對數(shù)生長期，隨著細(xì)胞密度的增大，第7～8天形成一個平臺期。這說明本實驗分離培養(yǎng)的MSCs增殖及活力良好，可用于下一步的實驗研究。

本實驗通過總結(jié)各種已報道的干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，吸取各自優(yōu)點并加以改進(jìn)，分離培養(yǎng)出了純度很高的瘢痕疙瘩MSCs，細(xì)胞形態(tài)為較均一的長梭形，與成纖維細(xì)胞類似，呈不規(guī)則放射狀生長。這為下一步關(guān)于瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制的研究打下了良好的基礎(chǔ)。

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(編輯 國 榮)

Isolation and culture of human keloid-derived mesenchymalstem cells and their growth curve

SONG Hai-feng, LIU Tao, ZHANG Yan-guo

(Department of Dermatology, Tangdu Hospital of Fourth MilitaryMedical University, Xi’an 710038, China)

Objective To investigate the method to culture high-purity keloid-derived mesenchymal stem cells (MSCs). Methods The keloid tissue samples were collected from the skin of 4 patients hospitalized in our department. The lesioned areas were the chest and the back. The human keloid cells were cultured with the serial culture medium in the following order: DMEM∶F12/(100 mL/L)fetal bovine serum (FBS), then low-glucose DMEM/(100 mL/L)FBS, low glucose DMEM/(10 mL/L)FBS, and last serum-free stem cell medium. Then we observed cell morphology and identified cell surface markers by flow cytometry method. Results We obtained high-purity fiber-like cells of long spindle and uniform shape by the serum gradient culture method. The expression of cell surface markers detected by flow cytometry was 99.99% for CD29, 99.7% for CD44, 0.69% for CD45, and 99.96% for CD73. Conclusion High-purity keloid-derived mesenchymal stem cells can be obtained by the culture method of decreasing serum concentration gradient.

keloid; mesenchymal stem cell; CD29; CD44; CD45; CD73; cell growth curve

2013-12-26

2014-03-13

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30900772) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30900772)

張衍國，副教授. E-mail: tdxbyzw@fmmu.edu.cn

宋海峰(1981-)，男(漢族)，技師，碩士. 主要研究方向：瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制. E-mail: songhaifeng168@126.com

時間：2014-06-27 09∶46 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140916.1121.001.html

R751; Q813

A

10.7652/jdyxb201406026