王 芳,石 悅,曹 健
(中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院藥學(xué)部,重慶 400037)
延腎膠囊是我院研制的非標(biāo)準(zhǔn)制劑,由淫羊藿、大黃、三七、黃芪、川芎、當(dāng)歸、生地、白芍等8 味中藥材經(jīng)加工制成的復(fù)方制劑,具有活血化瘀、生血止血、利水滲濕等功效,臨床主要用于治療慢性腎炎、慢性腎功能衰竭1 至3 期、急性腎功能衰竭恢復(fù)期。為控制膠囊質(zhì)量,筆者以方中主藥淫羊藿的主要成分淫羊藿苷為指標(biāo),參考有關(guān)文獻[1-5],用高效液相色譜(HPLC)法測定延腎膠囊中淫羊藿苷含量,現(xiàn)報道如下。
Waters 600 型高效液相色譜儀(美國Waters 公司);ME235s型電子天平(德國Sartorius);CSF-1A 型超聲波發(fā)生器(上海超聲波儀器廠)。淫羊藿苷對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號為110737 -200312);延腎膠囊(0.45 g/粒,自制,批號分別為120629,120925,121108);缺淫羊藿的陰性對照膠囊(自制);乙腈為色譜純,水為超純水(自制),其他試劑均為分析純。
色譜柱:Hypersil ODS 柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-水(25 ∶75);檢測波長:270 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;進樣量:20 μL。
精密稱取淫羊藿苷對照品10.0 mg,置50 mL 量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密吸取2.5 mL 置25 mL 量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,即得每1mL 含淫羊藿苷0.02 mg 的對照品溶液。取本品10 粒,精密稱定,取膠囊內(nèi)容物,研細(xì),稱取細(xì)粉約0.5 g,精密稱定,置25 mL 容量瓶中,加50%乙醇20 mL,超聲處理30 min,放冷至室溫,加50%乙醇至刻度,搖勻,過濾,精密吸取續(xù)濾液10 mL,置水浴上蒸干,加水10 mL 溶解,以乙酸乙酯萃取3 次,每次10 mL,合并乙酸乙酯萃取液,揮干,殘渣用50%乙醇溶解轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中,并用50%乙醇定容至刻度,搖勻,以0.45 μm 微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。按處方工藝制備缺淫羊藿的陰性對照品,取其內(nèi)容物約0.5 g,精密稱定,按供試品溶液制備方法制備缺淫羊藿的陰性對照品溶液。
干擾試驗:取2.2 項下3 種溶液,分別進樣20 μL,記錄色譜圖(圖1)。結(jié)果表明,陰性對照品溶液對樣品中淫羊藿苷的測定幾乎無干擾。
圖1 高效液相色譜圖
線性關(guān)系考察:精密稱取淫羊藿苷對照品10.0 mg,置50 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,分別精密吸取1.5,2.0,2.5,3.0,3.5 mL,置25 mL 容量瓶中,分別加甲醇稀釋至刻度,搖勻。分別精密吸取20 μL,注入高效液相色譜儀,測定峰面積。以峰面積(A)對質(zhì)量濃度(C)進行線性回歸,得回歸方程A =43 132 C -5 996.5,r =0.999 8(n =5)。結(jié)果表明,淫羊藿苷質(zhì)量濃度在12.0 ~28.0 μg /mL 范圍內(nèi)與峰面積值線性關(guān)系良好。
精密度試驗:取淫羊藿苷對照品溶液,重復(fù)進樣5 次,測定淫羊藿苷峰面積。結(jié)果平均峰面積為858 119,RSD =0.25%(n=5),表明儀器精密度良好。
重復(fù)性試驗:取同一批(批號為121108)供試品5 份,按供試品溶液的制備方法制備溶液,每次進樣20 μL,測定峰面積,計算含量。結(jié)果淫羊藿苷平均含量為2.503 mg/g,RSD=2.01%(n=5),表明方法重復(fù)性良好。
穩(wěn)定性試驗:精密吸取同一供試品溶液20 μL,于0,1,2,4,8 h 時進樣,記錄每次進樣的峰面積。結(jié)果淫羊藿苷峰面積的RSD =1.28%(n=5),表明供試品溶液在8 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。
加樣回收試驗:取已知淫羊藿苷含量(2.503 mg/g)的樣品(批號為121108)約0.25 g,精密稱定,共6 份,分別精密加入質(zhì)量濃度為0.2 g/L 的淫羊藿苷對照品溶液3.0 mL,用供試品溶液制備方法制備溶液,按上述色譜條件測定含量,計算回收率。結(jié)果見表1。
表1 淫羊藿苷加樣回收試驗結(jié)果( n=6)
取3 批樣品,依法制備供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μL 進樣,測定峰面積,計算淫羊藿苷的含量。結(jié)果批號為120629,120925,121108 的樣品,每粒中淫羊藿苷平均含量分別為0.927,0.905,1.126 mg(n=3)。
延腎膠囊為中藥復(fù)方制劑,成分復(fù)雜,本試驗以淫羊藿苷作為含量測定指標(biāo)。通過紫外掃描,結(jié)果淫羊藿苷對照品溶液在270 nm 波長處有最大吸收,故選270 nm 為測定波長。
[1-4]選用乙腈-水作為流動相,50%乙醇作為提取溶劑,經(jīng)多次試驗,以乙腈-水(25 ∶75)為流動相時分離效果較好。在供試品溶液的制備過程中,對回流提取法、超聲提取法及提取時間15,30,45,60 min 分別進行了比較,結(jié)果兩種提取方法結(jié)果無顯著差異,提取時間30 min 便可提取完全,故選用操作簡便的超聲提取法提取30 min。又因超聲提取法提取的雜質(zhì)較多,本試驗根據(jù)淫羊藿苷的溶解性質(zhì)[5]再將提取液以乙酸乙酯提取、純化,結(jié)果能使提取的雜質(zhì)大為減少。
采用高效液相色譜法測定延腎膠囊中淫羊藿苷的含量,方法簡便易行,重現(xiàn)性好,可用于延腎膠囊的質(zhì)量控制。
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