楊樹生物能源真菌的篩選研究

趙桂華 蔣繼宏 趙 楠

(1．江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400；2．江蘇師范大學(xué)江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221000)

楊樹生物能源真菌的篩選研究

趙桂華1,2蔣繼宏2趙 楠1

(1．江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400；2．江蘇師范大學(xué)江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221000)

為了篩選楊樹上潛在的生物能源油脂真菌，對(duì)5種楊樹的健康樹皮、韌皮部、邊材和葉片真菌組織進(jìn)行分離和鑒定，并檢測(cè)了菌絲和孢子內(nèi)含油脂。結(jié)果表明,試驗(yàn)共分離 4 674 塊組織，得到真菌菌落 4 501 個(gè)，占分離組織總數(shù)的96.3%，細(xì)菌菌落173個(gè)，占3.7%。其中非產(chǎn)油脂真菌菌落 4 043 個(gè)，占89.8%； 產(chǎn)油脂菌落458個(gè)，占整個(gè)菌落總數(shù)的10.2%。根據(jù)真菌的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，其隸屬于接合菌門、擔(dān)子菌門和半知菌亞門10屬，80%為半知菌亞門的真菌，其中，腐皮鐮刀菌是一株高產(chǎn)油脂的真菌。產(chǎn)油脂真菌的出現(xiàn)與楊樹種類和季節(jié)無相關(guān)性，而與真菌種類有關(guān)系。

楊樹；生物能源；油脂真菌；篩選；鑒定

生物能源真菌，又稱油脂真菌或脂肪真菌，是指在真菌個(gè)體中存在大量的油脂或脂肪體。真菌是綠色能源的一個(gè)全新發(fā)現(xiàn)，科學(xué)家們正在研究利用各種資源微生物，尋找和開發(fā)富產(chǎn)高油脂的微生物，這可能是解決部分能源的途徑之一。如粉紅粘帚霉(Gliocladiumroseum)可產(chǎn)生多種烴類組分的生物燃料，油脂酵母屬(Lipomyces)、鐮刀菌屬(Fusarium)、被孢霉屬(Mortierella)的油脂真菌可產(chǎn)生飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸。隨著我國(guó)用于農(nóng)作物種植的土地資源不斷減少，合理利用自然界的產(chǎn)脂微生物，將是今后長(zhǎng)期的一項(xiàng)重要任務(wù)。真菌生物油脂的開發(fā)符合國(guó)民經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略，可以緩解部分能源緊缺矛盾，備受各國(guó)重視。

由真菌、細(xì)菌和藻類產(chǎn)生的生物油脂，又稱單細(xì)胞油質(zhì)[1]。微生物細(xì)胞內(nèi)合成和貯存的油脂超過細(xì)胞干質(zhì)量的20%，稱為產(chǎn)油微生物[2-3]，從產(chǎn)油微生物中提取的油脂稱為微生物油脂。如斯達(dá)氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)菌體油脂含量為52%[4]，有些微生物菌體油脂含量可達(dá)到60%以上[5-6]，菜豆殼球孢菌(Macrophominaphaseolina，MOD-1)不飽和脂肪酸含量為74.32%[7]。真菌油脂的主要成分是飽和脂肪酸(棕櫚酸、硬脂酸)和不飽和脂肪酸(油酸、亞油酸和棕櫚油酸)[8]，如深黃被孢霉(Mortierellaisabellina)的油脂內(nèi)含有4.6%的花生四烯酸、5.78%～6.59%的C-亞麻酸[9]、 9.44%的γ-亞麻酸[10], 高山被孢霉(M.alpine)[11]、水霉(Saprolegoniasp.)和輪梗霉(Diasporangiumsp.)菌體內(nèi)產(chǎn)生的油脂屬于二十碳五烯酸(EPA)和ω-3多不飽和油脂酸[12]?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)被孢霉屬(Mortierella)、根霉屬(Rhizopus)、小克銀漢霉屬(Cunninghamella)能產(chǎn)生新的α-亞麻酸，一些低等絲狀真菌成了α-亞麻酸的又一新來源。真菌是一種可再生的生物資源，一株優(yōu)良的油脂真菌應(yīng)具備營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖快、周期短、適應(yīng)性強(qiáng)、能規(guī)?；囵B(yǎng)、可連續(xù)生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。

在真菌界五個(gè)亞門的真菌中，每一個(gè)亞門都有產(chǎn)油脂真菌；在子囊菌亞門中，科學(xué)家對(duì)內(nèi)孢霉目(Endomycetales)的產(chǎn)油脂酵母菌的研究最多，其他幾個(gè)亞門的產(chǎn)油脂真菌種類和數(shù)量有差異。國(guó)外對(duì)油脂真菌灰綠青霉(Penicilliumglaucum)的研究始于1894年，從該菌的分生孢子中提抽到了7%的油脂[13]。第一次世界大戰(zhàn)期間，德國(guó)為了解決油源匱乏問題，利用產(chǎn)脂內(nèi)孢霉(Endomycesvernalis)生產(chǎn)油脂，20世紀(jì)40年代發(fā)現(xiàn)斯達(dá)氏油脂酵母(Lipomicesstarkeyi)、膠粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)、曲霉屬(Aspergillus)及毛霉屬(Mucor) 等高產(chǎn)油脂真菌[14-15]，后來在美國(guó)，日本，英國(guó)，法國(guó)分別對(duì)被孢霉屬(Mortierellaspp.)[9]、曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusaroum)、青霉屬(Penicillium)、根霉屬(Rhizopus)以及酵母菌的產(chǎn)脂能力進(jìn)行了研究[16]。我國(guó)對(duì)產(chǎn)脂真菌的研究主要集中在鞭毛菌[12,17-20]、接合菌[18,20-22]、子囊菌及半知菌亞門的交鏈孢(Alternariasp.)、曲霉(Aspergillussp.)、擬莖點(diǎn)霉(Phomopsissp.)[23]、菜豆殼球孢(Macrophominaphaseolina，MOD-1)[7]、莖點(diǎn)霉(Phomasp.)[24]和黑核桃(Juglansregia)內(nèi)生真菌HJ1(無真菌名稱)等方面[8]。

在過去的幾十年里，我國(guó)報(bào)道的含油脂菌株大多數(shù)都是從土壤、水、農(nóng)作物剩余物中分離得到，少數(shù)來自黑核桃[8]、意大利楊(Populuseuramevicana)[24]、桑樹(Mulussp.)[7]等木本植物。本研究通過對(duì)5種健康楊樹的組織分離、純化、鑒定，從中篩選油脂含量高、具有開發(fā)潛力的真菌菌株，為今后的油脂開發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

從2009年6月至2010年12月，分別在山東省費(fèi)縣、沂南縣、沂水縣和蒙陰縣，江蘇省泗陽(yáng)縣和句容市采集5～20年生的I-69楊(PopulusdeltoidesBartr. cv. Lux′)、I-72楊(P.deltoidesBartr. cv. ‘Lux’)、南林351楊(P.deltoidesharvard. ×P.deltoideslux)、I-107楊(Populus×euramericanaCL ‘74/76’)和南林895楊(Populus×euramericanacv. ‘Nanlin895’)的健康樹皮、韌皮部、邊材和新鮮葉片，帶回實(shí)驗(yàn)室供組織分離使用。從江蘇句容市到山東沂水縣采集地位于北緯31°84′00″～35°54′00″，東經(jīng)117°24′00″～120°68′00″, 海拔30～100 m，使用GPS測(cè)定采集地點(diǎn)的地理方位。

1.2 真菌組織分離法

取楊樹的健康樹皮、韌皮部、邊材和葉片，用70%乙醇棉球擦3次后，在酒精燈上燒去多余的乙醇，用無菌的解剖刀切取組織進(jìn)行分離[25]，每個(gè)樣品分別分離40～50皿，每皿5～6塊組織，放入(25±1)℃、RH 70%、黑暗的PRX-250A智能人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)。5 d后檢查統(tǒng)計(jì)每種楊樹上各類真菌出現(xiàn)的頻率，并進(jìn)行純化培養(yǎng)，保留菌種待用。

1.3 菌絲和孢子內(nèi)含油脂的檢測(cè)方法

在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d的菌落，通過肉眼觀察后，做成臨時(shí)玻片在德國(guó)蔡斯ZEISS Imager.A1光學(xué)顯微鏡下觀察(不染色)。以看到菌絲和孢子內(nèi)有油脂球體存在為標(biāo)準(zhǔn)，再根據(jù)油脂顆粒大小和多少確定含油量的高低，對(duì)于富含油脂的菌株將進(jìn)一步純化保存。

1.4 真菌鑒定

在PDA上培養(yǎng)7 d后，觀察菌落形態(tài)、顏色和生長(zhǎng)速度，根據(jù)不同真菌的顯微形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。

1.4.1 接合菌亞門和擔(dān)子菌亞門的真菌培養(yǎng) 按照正常的PDA平板培養(yǎng)方法，在5～7 d內(nèi)均可產(chǎn)生孢子。

1.4.2 絲孢綱真菌的培養(yǎng) 由于絲孢綱真菌不產(chǎn)生子實(shí)體，并在較短的時(shí)間內(nèi)就能產(chǎn)生分生孢子梗和分生孢子，可采用載玻片培養(yǎng)法[26]培養(yǎng)1～3 d(因真菌種類不同，產(chǎn)生分生孢子的時(shí)間長(zhǎng)短也不同)；能夠很清楚的看到分生孢子梗和分生孢子的產(chǎn)生方式。

1.4.3 腔孢綱真菌的培養(yǎng) 在PDA培養(yǎng)基上，黑盤孢目和球殼孢目的真菌需要經(jīng)過10～20 d的培養(yǎng)，待產(chǎn)生分生孢子盤或分生孢子器，并有成熟的分生孢子時(shí)，用徒手切片法或石蠟切片機(jī)將子實(shí)體切成10～15 μm厚度。

將以上3種培養(yǎng)方法產(chǎn)生的孢子做成臨時(shí)玻片，在德國(guó)蔡斯ZEISS Imager.A1光學(xué)顯微鏡下觀察接合菌亞門孢囊梗、孢子囊和孢囊孢子，擔(dān)子菌亞門和半知菌亞門分生孢子梗和分生孢子的形成方式、大小、形狀、顏色，并拍照、測(cè)量，根據(jù)各個(gè)菌株的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定[27-33]。不產(chǎn)生任何孢子的菌株和細(xì)菌暫未作鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 油脂真菌的分離

不同種類的楊樹或同一株楊樹不同部位的真菌種類和數(shù)量稍有差異。本研究共分離 4 674 塊組織，得到真菌菌落 4 501 個(gè)，占分離組織的96.3%，細(xì)菌菌落173個(gè)，占3.7%。在 4 501 個(gè)菌落中，非產(chǎn)油脂真菌菌落 4 043 個(gè)，占89.8%；產(chǎn)油脂菌落458個(gè)，占10.2%，5種楊樹不同分離部位的產(chǎn)油脂菌株數(shù)量為6.3%～14.8%(表1)。

從各種楊樹不同部位分離到的菌株鏡檢結(jié)果表明，雖然在任何部位都有可能存在產(chǎn)油脂真菌，但分布無規(guī)律，至于一些優(yōu)良的產(chǎn)油脂真菌存在楊樹哪一個(gè)部位，取決于真菌種類。

表1 不同楊樹的油脂真菌分離

2.1.1 從菌落形態(tài)特征初步判斷產(chǎn)油脂真菌 通過對(duì)菌落顏色觀察，可以初步判斷真菌菌絲內(nèi)是否含油脂。大多數(shù)油脂含量較高菌落一般都會(huì)有白色、紅色、淡黃色、黃色和深黃色(圖1)，絨毛狀的氣生菌絲，仔細(xì)觀察會(huì)發(fā)現(xiàn)菌落表面有類似小油點(diǎn)的亮光，這是鐮刀菌(Fusariumspp.)和枝頂孢(Aremoniumspp.)的一些種類菌落特征，腐皮鐮刀菌是一株高產(chǎn)油脂的真菌。少數(shù)無氣生菌絲的、黑色菌落的菌絲內(nèi)也含有較高油脂，如褐棗霉(Spadicoidesbina)、盾殼霉(Coniothyriumsp.)。

2.1.2 鏡檢確定含油脂真菌 確定產(chǎn)油真菌可采用菌落觀察和顯微鏡檢查相結(jié)合的方法。由不同真菌的鏡檢結(jié)果可以看出，每一種真菌產(chǎn)油脂數(shù)量，以及真菌在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)油脂時(shí)間均有明顯差異。菌絲內(nèi)油脂體的大小與產(chǎn)油量直接相關(guān)，油脂體的形狀有球形、橢圓形、圓柱形、長(zhǎng)方形、啞鈴形(圖2)，雖然不同真菌的油脂形狀有差異，但在同一種真菌的菌絲內(nèi)油脂形狀和大小也不同，單個(gè)油脂體的大小為2.1～63.7 μm。在一個(gè)菌絲細(xì)胞內(nèi)能產(chǎn)生一個(gè)至多個(gè)油脂體，且大小和形狀不同。因真菌種類不同，故油脂體在菌絲內(nèi)存在的狀態(tài)也有差異，有的油脂體在菌絲內(nèi)不易被壓出來，如彎孢(Curvularialunata)、褐棗霉(S.bina)、鐮刀菌(Fusariumspp.)等菌株；而有些真菌的油脂極易被從菌絲中壓出來，如膠孢炭疽(Colletotrichumgloeosporioides)見圖3。在顯微鏡下可見油脂體的顏色有深淺之分，可能與油脂種類、產(chǎn)生時(shí)間及不同觀察面有關(guān)(圖2)，甚至同一真菌的不同生長(zhǎng)階段(或培養(yǎng)時(shí)間)油脂含量也有差異，在大多數(shù)的含油脂真菌中，以培養(yǎng)(5±1)d油脂產(chǎn)生的數(shù)量最多。有些真菌油脂體小，數(shù)量多；而另一些真菌的油脂體大，數(shù)量相對(duì)少，油脂含量相對(duì)較高；特別是菌絲粗、油脂體大、數(shù)量多、不產(chǎn)生孢子的菌株應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注。同一種真菌可存在于不同的楊樹上。

張曉昱等[13]用蘇丹系列染色法確定真菌菌絲內(nèi)的油脂體[20,34]，而本研究沒有采用任何染色方法，只是通過菌落顏色和在光學(xué)顯微鏡下直接觀察確定菌絲內(nèi)油脂體存在，這樣可初步篩選具有潛在開發(fā)應(yīng)用潛力的優(yōu)良菌株。

2.2 產(chǎn)油真菌鑒定

根據(jù)在顯微鏡下觀察、測(cè)量的形態(tài)特征，對(duì)458個(gè)產(chǎn)油脂真菌菌株進(jìn)行歸類和初步鑒定。結(jié)果表明，其隸屬于接合菌門、擔(dān)子菌門和半知菌亞門的10屬真菌(表2)，但以半知菌的種類最多。在孢球托霉屬、鬼傘屬、盾殼霉屬、棗褐霉屬中只分離到1個(gè)種，而在鐮刀菌屬、炭疽菌屬、枝孢菌屬中分離到多種產(chǎn)油脂真菌，可能將成為今后研究開發(fā)的潛在真菌。雖然有少部分真菌的油脂含量較高，因不產(chǎn)生孢子，故未作鑒定，也未在表2中列出。

2.3 產(chǎn)油脂微生物種類

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)記載的油脂真菌有34屬，40種(不包括無種名的)；細(xì)菌1屬1種，為嗜熱油脂芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)，見表3。大量研究證明，能夠產(chǎn)生油脂的微生物絕大多數(shù)是真菌，其中研究最多、最具有開發(fā)研究?jī)r(jià)值的是小克銀漢屬(Cuninghamella)、被孢霉屬(Mortierella)、毛霉屬(Mucor)、青霉屬(Penicillium)和酵母菌屬(Lipomyces)。

表2 不同楊樹上的產(chǎn)油脂真菌種類

表3 產(chǎn)油脂真菌和細(xì)菌種類

3 結(jié)論與討論

從5種不同楊樹上共分離 4 674 塊組織，得到真菌菌落4501個(gè)，占分離組織的96.3%。通過菌落外觀和鏡檢，確定產(chǎn)油脂菌落458個(gè)，占整個(gè)菌落總數(shù)的9.8%，證明在楊樹的任何部位都存在不同種類的真菌和細(xì)菌。根據(jù)產(chǎn)油脂真菌菌株的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，它們隸屬于接合菌門、擔(dān)子菌門和半知菌亞門的10屬真菌，少部分真菌菌株的油脂含量較高，具開發(fā)潛力，其中，腐皮鐮刀菌是一株高產(chǎn)油脂的真菌，絕大部分產(chǎn)油脂菌株在楊樹上屬于首次報(bào)道。

本研究使用的楊樹只占到楊樹種類的約5%，在其他楊樹中還存一些具有開發(fā)潛力的產(chǎn)油脂真菌，隨著研究水平不斷提高和資金支持加大，將會(huì)給楊樹生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來新的利潤(rùn)增長(zhǎng)點(diǎn)。楊樹上產(chǎn)油脂真菌的價(jià)值，完全取決于研究開發(fā)能力。因此，楊樹的價(jià)值可以通過銷售木材和產(chǎn)油真菌應(yīng)用后產(chǎn)生的效益來體現(xiàn)。

在菌株鑒定過程中，有少部分產(chǎn)油脂真菌不產(chǎn)生孢子，這給真菌的形態(tài)鑒定帶來一定困難，但其中比較容易產(chǎn)生分生孢子的真菌具有更高的油脂含量，這種現(xiàn)象在真菌生長(zhǎng)和孢子產(chǎn)生的過程中消耗了部分油脂，還是菌株之間存在差異有待研究。在過去的研究中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)油真菌與季節(jié)存在一定關(guān)系，在每年12月至翌年1月，有些常綠木本植物葉片上的產(chǎn)油真菌數(shù)量要比夏季多15%～20%，也可能是真菌體內(nèi)儲(chǔ)存油脂是為了抵抗外界的不良環(huán)境。在楊樹上，冬季和夏季的含油脂菌株的數(shù)量變化不明顯。

從人類社會(huì)發(fā)展的長(zhǎng)遠(yuǎn)角度來看，高油脂真菌的開發(fā)應(yīng)用將是今后研究的熱點(diǎn)，也是解決生物能源的一條途徑，特別是那些具有合成不飽和脂肪酸的真菌菌株的篩選更值得關(guān)注。用于生產(chǎn)的真菌須具備合成油脂的能力強(qiáng)，油脂積累量大，含油量穩(wěn)定在50%以上。油脂產(chǎn)量的高低與真菌種類相關(guān)，盧東升等[48]研究結(jié)果證明，茶樹上的高產(chǎn)油脂真菌集中存在擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis)及鐮刀菌屬(Fusarium)的菌株中，茶葉提取液可促進(jìn)真菌油脂的合成。

真菌油脂主要以油脂體的形式貯存于細(xì)胞質(zhì)中。近幾十年來，由于人口增加和工業(yè)發(fā)展加快，人均耕地面積減少，對(duì)微生物油脂的研究開發(fā)越來越多，在歐洲、中東、南亞和澳洲等地已允許將某些微生物油脂添加到嬰兒食品中[38]。伴隨世界性能源物質(zhì)的短缺，利用微生物油脂開發(fā)生產(chǎn)生物柴油和其他生物產(chǎn)品將會(huì)越來越引起人們的重視。

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(責(zé)任編輯 韓明躍)

Screening Bio-Energy Fungi fromPopulus

ZHAO Gui-hua1,2, JIANG Ji-hong2, ZHAO Nan1

(1. Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry, Jurong Jiangsu 212400, China; 2. The Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plants of Jiangsu Province, Jiangsu Normal University, Xuzhou Jiangsu 221000, China)

In order to screen some potential oleous fungi, fungus tissue of healthy bark, phloem, sapwood and leaf from fivePopuluswere isolated, and detection mycelia and grease content in spore. The results showed that there were 4 501 fungus colonies from 4 674 poplar tissues, accounting for about 96.3%, and bacteria colonies accounting for 3.7%. Among of them, no-oleous fungal colonies were 4 043, accounting for 89.8%, and oleous fungal colonies were 458, accounting for 10.2%. The authentication results of oleous fungals by morphological characteristics showed that, these oleous fungals belonged to Zygomycota, Basidiomycota and Deuteromycotina, and 80% of them belonged to imperfect fungi. Among them,Fusariumsolaniwas a fungus with high oil yield. No correlation between the fat producing fungi appeared andPopulusspecies and seasonal, but correlated to the fungal species.

Populus; bio-energy; oleous fungi; screening; identification

2014-07-07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170605)資助。

10.3969/j.issn.2095-1914.2014.06.001

S718.81

A

2095-1914(2014)06-0001-08

第1作者：趙桂華(1952—)，男，教授。研究方向：林木真菌。Email:172368691@qq.com。