秦愛麗,沈君琪,陳凌,童孟新,邵華,李鑫偉
(嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與環(huán)境分院,浙江嘉興314036)
馬齒莧(Porlulaca oleracea L.)屬馬齒莧科一年生肉質(zhì)草本植物,具有抗菌、降血脂、抗衰老、松弛肌肉、抗炎、鎮(zhèn)痛以及促進(jìn)傷口愈合等功效[1-6]。馬齒莧既可入藥,又可食用,是我國衛(wèi)生部劃定的78種藥食同源的野生植物之一。國外許多學(xué)者研究了馬齒莧的抗菌作用[7-12],國內(nèi)也有不少學(xué)者對馬齒莧提取物的研究表明它具有殺菌作用,如用馬齒莧煎煮液,口服治療急性胃腸道感染性疾病不僅對致病菌有直接殺傷作用,而且直接補(bǔ)充和糾正了因嘔吐和腹瀉所引起的胃腸液大量丟失及酸堿失衡[13];馬齒莧水煎劑體外抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對6種常見致病菌有明顯的抑菌作用[14]等。國際上,食品添加劑的發(fā)展趨向是天然、營養(yǎng)和功能化方面發(fā)展,而馬齒莧提取物符合這些條件,它有可能成為一種天然無毒的多功能食品防腐劑。本文采用微波輔助熱水浸提、乙醇浸提法提取馬齒莧活性成分,用正交試驗(yàn)對提取條件進(jìn)行優(yōu)化,以期尋找最佳提取工藝條件,為該珍貴野生植物資源的開發(fā)利用提供參考。
野生馬齒莧,采于嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院校園內(nèi),經(jīng)嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院陳玉琴副教授鑒定。將新鮮馬齒莧全草洗凈,晾至表面無水分,于80℃恒溫干燥,取出后粉碎,石油醚脫脂,35℃烘干備用。95%酒精、葡萄糖、濃硫酸、苯酚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸氫鈉均為分析純:上海聯(lián)試化工試劑有限公司;蘆丁、沒食子酸:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Folin-Ciocalteu試劑:上海荔達(dá)生物科技有限公司。
RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:鞏義市英峪高科儀器廠;DK-S24型恒溫水浴鍋:上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;722分光光度計(jì):上海海爭電子科技有限公司;賽多利斯電子天平:賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;格蘭仕G80W23CSL-A6K微波爐:廣東格蘭仕集團(tuán)公司;202-2A數(shù)顯電熱恒溫干燥箱:杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠;Smartpark DQ3純水柱,D-Q-3超純水儀等。
1.3.1 工藝流程
單因素實(shí)驗(yàn):馬齒莧粉→加溶劑微波輔助浸提→離心分離→上清液→濃縮→冷凍干燥→稱重。
正交試驗(yàn):馬齒莧粉→加溶劑微波輔助浸提→離心分離→上清液→濃縮→定容→測含量。
1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)
影響馬齒莧活性成分提取率的主要因素有提取劑、提取溫度、浸提時(shí)間、固液比和提取次數(shù)等。本實(shí)驗(yàn)稱取馬齒莧粉3.000 g,置于三角瓶中,按料液比(干粉重量∶溶劑,g/mL)1∶30按以下步驟加入溶劑提取。各水平試驗(yàn)3次取平均值。
1)提取溶劑的選擇:馬齒莧粉分別加入純水、60%酒精、95%酒精,放入微波爐中,在功率350 W條件下提取2 min后,于40℃的水浴中浸提30 min。濃縮提取液,冷凍干燥,稱重。
2)水浴浸提溫度的選擇:馬齒莧粉加入純水,放入微波爐中,在功率350 W條件下提取2 min后,分別置于40、50、70℃的水浴中浸提1 h。濃縮提取液,冷凍干燥,稱重。
3)水浴浸提時(shí)間的選擇:馬齒莧粉加入純水,放入微波爐中,在功率350 W條件下提取2 min后,分別置于50℃的水浴中浸提30 min、1 h和2 h。濃縮提取液,冷凍干燥,稱重。
1.3.3 正交試驗(yàn)
根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取料液比、微波時(shí)間、微波功率和浸提次數(shù)作為考察因素,各取3個(gè)水平,進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)化馬齒莧活性成分的提取工藝條件。
馬齒莧活性成分含量的測定主要測其葡萄糖、酚類、黃酮的含量,測定方法如下:
1)采用苯酚一硫酸法,以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品,分光光度計(jì)測定其多糖含量;
2)采用Folin-Ciocalteu方法,以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,比色法測定其總酚的含量;
3)采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法,以蘆丁為對照品,分光光度計(jì)測定馬齒莧黃酮的含量。
2.1.1 提取溶劑對提取率的影響
浸提溶劑對提取率的影響見表1。
表1 浸提溶劑對提取率的影響Table 1 Extraction solvents on extraction rate
由表1可知,提取溶劑為95%酒精時(shí)的提取率最高,但與水浸提相差不是很大,考慮到提取成本,選用純水作為提取溶劑。95%酒精的提取率最高,這與活性成分主要是有機(jī)物有關(guān),根據(jù)相似相溶原理有機(jī)物易溶于有機(jī)溶劑;而60%酒精的提取率最低,是因?yàn)榇颂崛┲兴c酒精形成氫鍵,而使浸提液與馬齒莧活性成分的作用力減弱,使其提取率降于純水。
2.1.2 浸提溫度對提取率的影響
浸提溫度對提取率的影響見表2。
表2 浸提溫度對提取率的影響Table 2 Extraction temperature on the extraction rate influence
由表2可知,提取劑為水時(shí)浸提溫度為70℃時(shí)提取率最高,50℃時(shí)最低。升高溫度,滲透、擴(kuò)散、溶解速度加快,有利于活性成分轉(zhuǎn)移至水中,提取率隨之提高;但溫度升高,揮發(fā)性成分也隨著揮發(fā),使提取率降低,50℃時(shí)提取率最低說明此溫度下?lián)]發(fā)性活性成分揮發(fā)。雖然70℃提取率明顯高于40℃的提取率,但考慮到能耗,選用40℃作為浸提溫度。
2.1.3 浸提時(shí)間對提取率的影響
浸提時(shí)間對提取率的影響見表3。
表3 浸提時(shí)間對提取率的影響Table 3 Extraction time on extraction rate influence
從表3可見,50℃時(shí)水浸提,浸提時(shí)間120 min的得率最高,但與30 min時(shí)的相差很小,60 min時(shí)提提取率最低??紤]到效率問題,選用30 min浸提時(shí)間。時(shí)間過短,活性成分還未充分溶出,但當(dāng)時(shí)間過長,活性成分的溶出量變化不大,這是由于提取時(shí)間過長,提取液內(nèi)有效成分濃度已達(dá)到平衡。再者揮發(fā)性物質(zhì)的揮發(fā)量增加,反而使提取率降低。
單因子實(shí)驗(yàn)的結(jié)果:用純水作為提取劑,在40℃浸提30 min為最佳選擇。
2.2.1 正交試驗(yàn)
稱取馬齒莧1.000 g,用純水在40℃浸提30 min,活性成分以多糖、酚類、黃酮提取率的總和為考察指標(biāo),選定4個(gè)因素3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn),因素水平見表4,正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。
表4 多糖提取正交試驗(yàn)因素水平表Table 4 Factors and levels of orthogonal of polysaccharides extraction
表5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案因素水平表L9(34)Table 5 Table of factors level of design plan
從表5可以看出,用純水浸提馬齒莧活性成分,各因素對活性成分得率的影響大小順序?yàn)椋毫弦罕龋疚⒉〞r(shí)間>浸提次數(shù)>微波功率,即A>C>D>B。由于微波功率對浸提效果的影響最小,考慮到能耗,選擇350 W。綜合分析得出最佳工藝條件為:料液比1∶50、微波1 min、浸提1次、微波功率350 W。
2.2.2 提取液中活性成分的含量
2.2.2.1 多糖含量
精密稱取105℃干燥恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.2 g,用蒸餾水溶解至100 mL容量瓶中定容,吸取5 mL此溶液再定容于100 mL容量瓶中,得到濃度為0.1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL 分別置于比色管中,加蒸餾水使體積為1.0mL,再加入體積分?jǐn)?shù)6%的苯酚溶液1mL,搖勻,迅速加入濃硫酸5.0 mL,搖勻,靜置至室溫,用分光光度法于490 nm處測定吸光度A,以糖濃度(c)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程是:A=0.560 7c+0.040 0,相關(guān)系數(shù)R2=0.997 9。
分別取正交試驗(yàn)的9種浸提液,按作標(biāo)準(zhǔn)曲線的同樣步驟測其吸光度,將A帶入回歸方程求得多糖濃度(c),然后計(jì)算出多糖得率(見表5)。
2.2.2.2 黃酮的含量
精密稱取蘆丁對照品200 mg,用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶解,定容到100 mL容量瓶中,搖勻,精密吸取10 mL,置于100 mL容量瓶中,用水定容,得到0.2 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液管準(zhǔn)確吸取 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液分別置于10 mL的比色管中,加入水1 mL,加入5%亞硝酸鈉0.4 mL,搖勻,放置 6 min,加入10%硝酸鋁 0.4 mL,搖勻,放置6 min,加入4.3%氫氧化鈉4.0 mL,再加水至刻度,搖勻,放置15 min,以試劑空白為參比,用分光光度計(jì)在500 nm處測定吸光度(A),以蘆丁濃度(c)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程:A=0.944 6c+0.017,相關(guān)系數(shù) R2=0.999 5。
同樣分別取正交試驗(yàn)的9種浸提液,按作標(biāo)準(zhǔn)曲線的同樣步驟測其吸光度,帶入回歸方程求得蘆丁濃度(c),然后計(jì)算出黃酮得率(見表5)。
2.2.2.3 酚類的含量測定
取沒食子酸0.2 g,蒸餾水溶解,且迅速定容到100 mL的容量瓶內(nèi),得2.0 mg/mL沒食子酸溶液。在從中移取10 mL沒食子酸溶液于100 mL容量瓶內(nèi),并加入蒸餾水,定容到100 mL,作為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取 0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,迅速加入0.6mL Folin-Ciocalteu試劑混勻,3 min后加入10%Na2CO3溶液1.5 mL,加入蒸餾水定容到10 mL。30℃避光反應(yīng)2 h,在750 nm處測定其吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為:A=8.580 8c+0.274 6,相關(guān)系數(shù) R2=0.999 1。
取上述九種浸提液1 mL于比色管內(nèi),同上述步驟測其吸光度,同理計(jì)算出酚類得率(見表5)。由表5可知:馬齒莧的水提物的主要成分是多糖,黃酮的含量很少,酚類的含量更少。
根據(jù)最佳工藝參數(shù)料液比1∶50、微波1 min、浸提1次、微波功率350 W,做3次平行試驗(yàn),活性成分提取率分別為32.6%、33.1%和32.8%,平均得率為32.8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.982%,重現(xiàn)性較好,因此此提取工藝條件為最佳選擇。
1)以馬齒莧活性成分中多糖、酚類、黃酮提取率的總和為指標(biāo),結(jié)合單因素及正交實(shí)驗(yàn)確定馬齒莧活性成分提取率的各因素影響順序:料液比>微波時(shí)間>浸提次數(shù)>微波功率。
2)綜合分析得出最佳工藝條件為:以純水為溶劑,料液比1∶50,微波時(shí)間1 min,浸提1次,微波功率350 W,浸提時(shí)間30 min,浸提溫度40℃。在此條件下多糖的含量比黃酮和酚類高得多,酚類含量最少,活性成分提取率可達(dá)33.0%。
3)用水作浸提劑馬齒莧的活性成分主要是多糖。
4)工藝簡單,可操作性強(qiáng),提取率高,所用水成本低和安全性高,所獲得的提取液濃縮物可用于功能食品、營養(yǎng)食品的原料。
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