王從軍， 陳 梅， 雷中勁

(1荊楚理工學院醫(yī)學院， 2荊門市第一人民醫(yī)院兒科, 湖北 荊門 448000)

川崎病(Kawasaki disease， KD)又稱皮膚黏膜淋巴結綜合征，其病因尚不清楚，是一種以全身血管炎為主要病理變化的急性發(fā)熱出疹性疾病，可以產(chǎn)生嚴重的心血管并發(fā)癥。因為在川崎病尸檢病例中發(fā)現(xiàn)損傷的血管組織中有IgA、漿細胞、單核/巨噬細胞、CD8+T 淋巴細胞浸潤，一般認為它是一種自身免疫性疾病[1]，但對川崎病患者細胞免疫和體液免疫功能異常的研究還沒有一致的結論[2-3]。本實驗擬通過半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測部分川崎病患兒外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)中T-bet 和GATA3 mRNA 轉錄量并同時采用三色熒光流式細胞術檢測川崎病患兒外周血Th1和Th2 細胞的比例，分別從轉錄水平和表達水平明確KD患兒T細胞功能狀態(tài)。

材 料 和 方 法

1 研究對象

以 2010 年3 月至 2011 年 9月入住荊門市第一人民醫(yī)院兒科的 41 例 KD 患兒為研究對象，其中男24例，女17例，年齡2月～5歲，均符合2004年美國兒科學會和心臟病學會聯(lián)合制定的KD診斷標準[4]，且回顧性診斷沒有誤診,根據(jù)彩色多普勒超聲診斷冠狀動脈有擴張的15例。同時選取年齡和性別相匹配的急性上呼吸道感染發(fā)熱兒童40 例為對照組。

2 儀器及試劑

Becton Dickinson流式細胞儀。刺激素為佛波酯+ionomycin+monensin(Sigma)?？贵w:細胞表面標記抗體,CD3-TC和CD8-FITC；細胞因子抗體,IL-4-PE和IFN-γ-PE。同型對照: Mouse IgG1-PE(對應于IL-4-PE)和Mouse IgG2-PE(對應于IFN-γ-PE)；IntraPrep破膜劑，以上均為Pharmingen產(chǎn)品。TRIzol購自深圳晶美公司； PCR試劑盒、DNA marker、逆轉錄酶、RPMI-1640、Taq酶及緩沖液為Promega產(chǎn)品。

3 方法

3.1PBMC的分離 用肝素抗凝管采集靜脈血至少 2 mL，采集后 4 h內(nèi)使用； 加入等體積的 Hank 平衡鹽緩沖液(HBSS, pH 7.2～7.4)稀釋血液，取與稀釋后血液等體積的淋巴細胞分層液(Ficoll 液)加入離心管中，將稀釋血液小心地加到淋巴細胞分層液上，注意保持兩者界面清晰，室溫下2 000 r/min離心 20 min； 用毛細吸管輕輕吸出單個核細胞層，加入含有 5 mL HBSS 的試管中，充分混勻, 1 500 r/min離心 10 min，棄上清后，再洗1次，棄上清，用 RPMI-1640(含 10%熱滅活 FBS)重懸單個核細胞，用臺盼藍染色計數(shù)活細胞數(shù)(應在 95%以上)； 調(diào)節(jié)細胞濃度為 2×109/L，-20 ℃凍存待測。

3.2總RNA的抽提與鑒定 按照TRIzol法提取PBMC總RNA。抽提完后分別用熒光分光光度計測定A260和A280并計算比值，進一步采取1%瓊脂糖電泳以分析RNA的純度和完整性, 見到典型3條條帶(5S、18S、28S)后行逆轉錄反應。

3.3RT-PCR檢測目的基因mRNA的轉錄量 總RNA提取鑒定后立即逆轉錄合成 cDNA以防降解，合成的cDNA置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯有蠵CR反應。PCR反應體系:10×PCR buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 5 μL, RT-PCR產(chǎn)物cDNA 2 μL，上游引物 20 μmol/L,下游引物 20 μmol/L，Taq polymerase 0.25 μL，滅菌水調(diào)總反應體積至50 μL。94 ℃預變性 5 min；94 ℃ 45 s,55 ℃ 50 s,72 ℃ 1 min，25個循環(huán)；72 ℃ 7 min。點取 T-bet、GATA3及 GAPDH擴增產(chǎn)物 10 μL在 1.2%瓊脂糖凝膠板孔中,100 V電泳20 min。凝膠電泳圖像輸入Kodak Digital Science System DC40凝膠成像系統(tǒng),應用圖像分析軟件進行各條帶平均灰度值分析,以同時擴增的 GAPDH為外參照,用轉錄因子/GAPDH的比值表示轉錄因子相對表達量。各對引物見表1。

表1 T-bet、GATA3、GAPDH PCR引物序列

3.4流式細胞術檢測Th1和Th2細胞 取 600 μL PBMC(2×109cells/L)于試管中，加入 10 μL 1 mg/L 佛波酯工作液 + 8 μL 50 mg/L ionomycin 工作液 + 6.8 μL 0.1 g/L monensin 工作液混勻，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4～6 h?；靹蚣毎尤?20 μL CD3-TC 和 20 μL CD8-FITC,室溫下避光孵育 15 min。將細胞分成4 管，每管加入 100 μL PBMC,編號為 A1、A2、A3和A4；每管中加入 100 μL Fix&Perm 中的 Reagent A(固定液)，室溫避光孵育15 min；每管中加入 3 mL PBS，1 200 r/min 離心 5 min，棄除上清；每管中加入 100 μL Fix&Perm 中的 Reagent B，同時各管中分別加入相應的抗體各 10 μL (A1: Mouse IgG1-PE;A2: IFN-γ-PE;A3: Rat IgG1-PE;A4: IL-4-PE)；室溫下避光孵育15 min。每管中加入3 mL PBS，1 200 r/min 離心5 min，棄除上清；取0.5 mL PBS重懸細胞，上機檢測，每一樣品檢測 20 000個細胞。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗， T-bet mRNA、GATA3 mRNA 分別與Th1、Th2細胞間的相關性采用Spearman相關分析法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 KD患兒與對照組患兒外周血淋巴細胞轉錄因子 T-bet及GATA3轉錄水平

由圖1和表2可見，KD患兒外周血淋巴細胞轉錄因子T-bet和GATA3 mRNA的水平均顯著低于對照組。

Figure 1. The electrophoretogram of T-bet, GATA3 and GAPDH mRNA in peripheral blood in KD group and control gorup.1: DNA marker; 3: T-bet mRNA of KD group; 4: T-bet mRNA of control group; 5: GATA3 mRNA of KD group; 6: GATA3 mRNA of control group; 7: GAPDH mRNA of KD group; 8: GAPDH mRNA of control group.

表2 KD組與對照組T-bet mRNA和GATA3 mRNA的 RT-PCR檢測結果

2 KD患兒外周血淋巴細胞亞群 Th1和Th2細胞百分率的變化

用 CD3 和 CD8反設CD4細胞，即 CD3+CD8-的細胞被認為是 CD3+CD4+的細胞。以散點圖IFN-γ和IL-4染色陽性分別表示Th1和Th2細胞，見圖2。用Cells Quest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)，流式細胞術檢測結果顯示KD患兒外周血淋巴細胞亞群Th1和Th2細胞的百分率顯著低于對照組(P<0.05)，Th1/Th2的比值與對照組相比無顯著差異(P>0.05)，見表3。

Figure 2. Detection of Th1 and Th2 cells in peripheral blood by flowcytometry method in KD group and control gorup.A: Th1 cells in flow cytometry graph of KD group; B: Th2 cells in flow cytometry graph of KD group; C: Th1 cells in flow cytometry graph of control group; D: Th2 cells in flow cytometry graph of control group.

表3 KD組與對照組Th1和Th2細胞流式細胞術檢測結果

3 T-bet mRNA與Th1細胞、GATA3 mRNA與Th2細胞間的相關分析

對全部81例研究對象T-bet和GATA3 mRNA半定量值與Th1、Th2細胞百分比分別進行Spearman相關分析，結果顯示T-bet mRNA轉錄量與Th1細胞比例呈正相關(r=0.69，P<0.05)，GATA3 mRNA轉錄量與Th2細胞比例呈正相關(r=0.65，P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The correlations between T-bet mRNA and Th1 cells (A), and between GATA3 mRNA and Th2 cells (B).

討 論

KD的病因及發(fā)病機制尚未清楚，多數(shù)學者認為本病與感染介導的免疫系統(tǒng)高度活化密切相關[5-6]。目前報道與川崎病發(fā)病有關的病原體有10余種，包括鏈球菌[7]、葡萄球菌[8]、支原體[9]、人類微小病毒B19[10]等。在感染等因素作用下，急性期CD4+T細胞數(shù)目增多，CD8+T細胞數(shù)目減少，CD4+T細胞表面CD40配體表達明顯增高，提示患兒細胞免疫功能紊亂[11]。但有實驗表明川崎病急性期CD4+調(diào)節(jié)性T 細胞數(shù)目減少，輔助性T 細胞Th1、Th2細胞產(chǎn)物減少，因此對于T細胞功能在兒童川崎病中的地位仍有爭議[12]。

T-bet是T-box轉錄因子家族中的新成員，不僅控制Th1細胞特征性細胞因子IFN-γ的表達，而且抑制Th2細胞特征性細胞因子 IL-4的產(chǎn)生，被確認為Th1特異性轉錄因子。GATA3是一個鋅指蛋白，屬于GATA家族成員，是Th2細胞特異的轉錄因子，GATA3不僅在Th2細胞分化過程中起關鍵作用，而且它還是所有Th2型細胞因子轉錄所必需的，能促使正在分化或已分化的Th細胞合成Th2細胞因子[13]。既往對川崎病患兒T細胞免疫功能狀況的研究主要通過采用ELISA的辦法檢測2種Th細胞的特異性因子來間接檢測Th1和Th2細胞的數(shù)目和功能[14]，本研究通過檢測兩種T細胞亞群的特異性轉錄因子T-bet和GATA3并采用細胞內(nèi)因子標記CD3、CD8設門的辦法用流式細胞術檢測外周血Th1和Th2細胞,進一步確定川崎病患兒T細胞功能狀態(tài)，結果顯示川崎病患兒急性期外周血PBMCs中T-bet mRNA和GATA3 mRNA低于對照組，提示川崎病急性期上述2種轉錄因子被不同程度抑制，而流式細胞術的檢測結果也顯示川崎病患兒外周血Th1和Th2細胞比例均較對照組顯著減少。Spearman相關分析顯示T-bet mRNA與Th1細胞比例、GATA3 mRNA與Th2細胞比例呈正相關。以上結果表明川崎病急性期PBMC中T-bet和GATA3 mRNA表達被抑制，相關表達產(chǎn)物減少，使Th細胞在向其亞群Th1、Th2轉化方面被抑制而導致了Th1和Th2細胞減少，提示川崎病患兒急性期T淋巴細胞并非活化而是處于抑制狀態(tài)，這和以往部分研究結果不一致。需要說明的是我們僅檢測了川崎病急性期T淋巴細胞免疫功能狀態(tài)，并不能完全反映川崎病亞急性期和恢復期特點，或許在川崎病的亞急性期和恢復期細胞免疫功能狀況逐漸被激活，而部分研究者因在不同病程時間采集標本從而造成研究結果不一致，也有可能川崎病發(fā)病時循環(huán)池淋巴細胞被抑制而周圍池被激活從而導致循環(huán)淋巴細胞減少，這需進一步動態(tài)測定川崎病各期T淋巴細胞功能狀況并對炎性血管壁局部組織中的淋巴細胞功能狀態(tài)進行研究加以證實。另外，我們也比較了川崎病患兒組與對照組兒童的Th1/Th2比值，并沒發(fā)現(xiàn)顯著差異，因此對于川崎病細胞免疫所起的作用還需進一步研究證實，同時對于川崎病急性期細胞免疫為什么被抑制也是需要通過進一步研究明確。

[參 考 文 獻]

[1] Yeung RS. Kawasaki disease: update on pathogenesis[J]. Curr Opin Rheumatol，2010, 22(5):551-560.

[2] Suzuki H, Suenaga T, Takeuchi T, et al. Marker of T-cell activation is elevated in refractory Kawasaki disease[J]. Pediatr Int, 2010, 52(5):785-789.

[3] Franco A, Shimizu C, Tremoulet AH, et al. Memory T-cells and characterization of peripheral T-cell clones in acute Kawasaki disease[J]. Autoimmunity, 2010, 43(4):317-324.

[4] Newburger JW, Takahashi M, Gerber MA, et al. Diagnosis, treatment, and long-term management of Kawasaki disease: a statement for health professionals from the Committee on Rheumatic Fever, Endocarditis and Kawasaki Disease, Council on Cardiovascular Disease in the Young, American Heart Association [J]. Circulation, 2004, 110(17):2747-2771.

[5] Principi N, Rigante D, Esposito S. The role of infection in Kawasaki syndrome [J]. J Infect, 2013, 67(1):1-10.

[6] 孫 飛，顧再研，丁韌燁，等. CD14+CD16+單核細胞在川崎病患兒中的變化[J]. 中國病理生理雜志，2008, 24(10):2042-2043.

[7] Matsubara K, Fukaya T. The role of superantigens of group AStreptococcusandStaphylococcusaureusin Kawasaki disease[J]. Curr Opin Infect Dis, 2007, 20(3):298-303.

[8] Guerineau LR, Burriel EG, Nebot MS, et al. Disseminated staphylococcal infection resembling Kawasaki disease[J]. An Pediatr (Barc), 2012, 76(3):176-177.

[9] Chemli J, Hassayoun S, Ketata S, et al. Kawasaki disease andMycoplasmapneumoniaeinfection[J]. Med Mal Infect, 2010, 40(12):717-719.

[10] 鄭 巖. 61例不完全性川崎病與微小病毒B19感染[J]. 中國實驗診斷學, 2012, 16(3):439-441.

[11] Guggino G, Cimaz R, Accomando S,et al. Increased percentages of tumor necrosis factor-alpha+/interferon-gamma+T [corrected]lymphocytes and calprotectin+/tumor necrosis factor-alpha+monocytes in patients with acute Kawasaki disease [J]. Int J Immunopathol Pharmacol, 2012, 25(1):99-105.

[12] Kimura J, Takada H, Nomura A, et al.Th1 and Th2 cytokine production is suppressed at the level of transcriptional regulation in Kawasaki disease[J]. Clin Exp Immunol, 2004, 137(2):444-449.

[13] Peine M, Rausch S, Helmstetter C, et al. Stable T-bet+GATA3+Th1/Th2 hybrid cells ariseinvivo, can develop directly from naive precursors, and limit immunopathologic inflammation[J]. PLoS Biol, 2013, 11(8):e1001633.

[14] 常 健，魯繼榮，梁 東，等. 川崎病患兒急性期 Th1/Th2細胞功能狀態(tài)的研究[J]. 中華兒科雜志, 2006, 44(5):377-378.