林 源，王志昇，李 勇，劉河濤，何生虎

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)；2.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院；3.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川750021）

動物披針葉黃華中毒主要是由其所含的生物堿成分的毒性作用所造成的[1][2]，動物中毒后會出現(xiàn)厭食、貧血、水腫、孕畜流產(chǎn)及神經(jīng)紊亂等臨床癥狀，心、肝、腎、脾等實質(zhì)器官會出現(xiàn)細胞空泡變性和水腫為主的病理變化[3][4]。由于披針葉黃華的生物堿成分多樣，并且每種生物堿的毒性作用不同，其中毒的機理至今仍未明確[5]。本實驗擬通過研究黃華堿對小鼠的毒性和毒理，證明其在披針葉黃華中毒中發(fā)揮的作用。

1 材料

1.1 實驗藥物 黃華堿由試驗從披針葉黃華植物中提取分離得到。披針葉黃華干草粉經(jīng)用酒精熱回流提取得浸膏，再經(jīng)酸化除雜，堿化萃取得到其總生物堿?？偵飰A經(jīng)硅膠柱層析分離后結(jié)晶形成黃華堿。黃華堿純化后經(jīng)氣相色譜儀檢測純度達96.1%。

1.2 實驗儀器與試劑 AR1140/C型電子分析天平，奧毫斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；HW 1A型電熱恒溫水溫箱，北京醫(yī)療設(shè)備廠；202-1型手搖式切片機，上海醫(yī)療器械四廠；HM500冰凍切片機，德國MICROM公司；H-600型透射電子顯微鏡，日本日立產(chǎn)；無水乙醇（AR），批號20040518，天津市瑞金特化學(xué)藥品有限公司；甲醛溶液（AR），批號20040205，天津市瑞金特化學(xué)藥品有限公司；二甲苯（AR），批號870116，西安化學(xué)試劑廠。

1.3 實驗動物 ICR小鼠80只，體重18－22g，雌雄各半，購于寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物均于室溫下自由飲水采食，所喂飼料為全價顆粒飼料，購于寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

2 實驗方法

2.1 實驗分組 分為預(yù)試驗組和試驗組兩組[6]。

①預(yù)試驗 取小鼠20只，雌雄各半，以4只為一組，分成5組。選擇組距較大的一系列劑量，每組腹腔注射黃華堿單體溶液，觀察出現(xiàn)的癥狀并記錄死亡數(shù)，找出引起0%死亡率和100%死亡率劑量的所在范圍。

②正式試驗 在預(yù)試驗所獲得的0%和100%致死量的范圍內(nèi)，選用5個劑量，每組10只小鼠，動物的體重和性別要均勻分配，完成動物分組和劑量計算后按腹腔注射給藥。立即詳細觀察，記錄動物反應(yīng)情況、死亡時間和數(shù)目。在24h內(nèi)連續(xù)觀察，以后每天觀察3次以上，連續(xù)觀察7～14天[7][8]。

2.2 黃華堿注射液的制備 定量稱取黃華堿，用滅菌注射用水溶解，配成所需濃度藥液，過濾至澄清，高溫滅菌備用。

2.3 給藥方法 本次試驗采用腹腔注射的方法，每只老鼠注射劑量為0.5m l。給藥前小鼠禁食3-6h。參考資料選擇初始藥物濃度給第一組小鼠給藥，如全死或全不死，組間濃度以0.8為公比向下減小或向上增加劑量，作為第二組小鼠給藥劑量。正式實驗在0%和100%致死量的范圍內(nèi)選擇給藥濃度，組間濃度公比為0.9[9][10]。以Bliss分析軟件計算半數(shù)致死量。

2.4 病理組織學(xué)檢查 小鼠死亡后，立即采集其肝臟、心臟、肺臟、腎臟、小腸、肌肉、大腦、脾臟，用10%福爾馬林溶液固定。石蠟包埋，常規(guī)切片，脫蠟，蘇木精-伊紅染色（HE染色），二甲苯透明，中性樹膠封片,光鏡觀察并拍照。經(jīng)HE染色后，細胞核被蘇木精染成紫藍色，多數(shù)細胞質(zhì)及非細胞成分被伊紅染成粉紅色，紅細胞染成桔紅色。顯微鏡檢查其病理組織學(xué)變化。

表1 黃華堿對小鼠毒性預(yù)實驗結(jié)果

表2 黃華堿對小鼠的毒性實驗結(jié)果

圖1 肝臟竇狀隙充血、 肝細胞索凌亂 (HE 染色)X40

圖2 肺泡毛細血管、 肺泡間隔、肺泡內(nèi)均有出血(HE 染色)X40

圖3 腎臟出血、腎小囊腔內(nèi)有脫落細胞 (HE 染色)X40

圖4 十二指腸腸粘膜出血充血(HE 染色)X40

3 實驗結(jié)果

3.1 預(yù)試驗結(jié)果 由預(yù)實驗結(jié)果（見表1），得出小鼠黃華堿中毒0%和100%致死量的范圍為205-400mg/kg。

3.2 正式實驗結(jié)果 由正式試驗小鼠的死亡情況（見表2），計算出回歸方程y(Probit)=-31.13+14.829Log(D)；黃華堿小鼠腹腔注射的半數(shù)致死量LD50=273.2mg/kg；LD50(Feiller校正)95%的可 信 限 =252.59--292.37mg/kg；LD5=211.62mg/kg；LD95=352.71mg/kg。

3.3 黃華堿中毒臨床癥狀 腹腔注射后1-2min出現(xiàn)明顯癥狀，起初小鼠躁動不安，活動增多，不時爬籠撞籠，后期抑制，精神沉郁，伏地，活動減少，嚴(yán)重者昏迷、抽搐，而后死亡，常于給藥3h后發(fā)生死亡。發(fā)病時呼吸困難，呼吸加深加快，呈喘息和腹式呼吸，眼、鼻、呼吸道分泌粘液增多，流淚，瞇眼，眼不能張呈線形，不時用前爪撓眼、鼻部位，后期出現(xiàn)角膜混濁，小鼠失明。耳部靜脈血管擴張充血，耳朵變紅，尾靜脈亦充血使尾巴發(fā)紅。

3.4 黃華堿中毒病理變化 對死亡小鼠剖解可見肺部水腫，充血、出血明顯。腎腫大，肝臟腫大，表面有針狀出血點。腹腔液體增多。病理組織學(xué)切片鏡檢可見肺臟、肝臟、腎臟變化明顯。肺臟肺泡毛細血管出血，肺泡間隔和肺泡內(nèi)均有大量出血，肺泡壁不完整。肝臟中肝細胞索凌亂、竇狀隙充血，肝細胞變性，出現(xiàn)空泡。腎小球囊腔普遍有脫離細胞，囊壁不清晰，遠曲小管細胞界限不清，有脫落現(xiàn)象。小腸固有膜有充血、出血現(xiàn)象。心肌及骨骼肌未見明顯病理變化。脾臟組織正常。腦組織見少量空泡化。見圖1～4。

4 分析與討論

4.1 黃華堿腹腔給藥后1-2min即出現(xiàn)中毒癥狀，常于3h后發(fā)生死亡，死亡前時間較長。而披針葉黃華總堿中毒后發(fā)生死亡的時間約在給藥后3至5min內(nèi)，死亡發(fā)生快。本實驗測得的黃華堿經(jīng)小鼠腹腔注射后的LD50為273.2mg/kg，而前期實驗測得的披針葉黃華總堿的小鼠腹腔注射的LD50為94.38mg/kg，所以黃華堿毒性小于披針葉黃華總堿。

4.2 小鼠黃華堿中毒在臨床癥狀和病理學(xué)變化均與金雀花堿中毒不同。小鼠黃華堿急性中毒主要表現(xiàn)呼吸困難等癥狀，而金雀花堿中毒主要表現(xiàn)為抽搐、跳躍等神經(jīng)癥狀另外。雖然兩種生物堿中毒后均會對機體肝、腎等多種臟器產(chǎn)生損害，黃華堿中毒小鼠的病理學(xué)變化卻主要以血管血細胞的大量滲出，各臟器的急性充血、出血為特征。因此，金雀花堿中毒與總堿中毒的癥狀及病理表現(xiàn)更為相似。另外，黃華堿只占披針葉黃華總堿的約5%，而金雀花堿在總堿中最高含量可達40%，故黃華堿在披針葉黃華總堿中毒中只起次要毒性作用。

[1]達能太、曹敏慧、劉圖雅等.阿拉善左旗草地家畜有毒植物中毒病研究[M].化學(xué)災(zāi)害醫(yī)學(xué)應(yīng)急救援,34-35

[2]孫啟忠，高淑靜.瘋草與家畜瘋草中毒[J].草與畜雜志，1993，（1）：32-34

[3]達能太,李忠德，趙巧娥等.綿羊披針葉黃華中毒病的研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）2003.31（2）:28-32

[4]朱忠珂、趙寶玉、何生虎等.披針葉黃華總生物堿對小鼠的毒性[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）,2003,31（2）：25

[5]朱忠珂、趙寶玉、何生虎等.披針葉黃華對奶山羊的毒性[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2005，36（1），82-86

[6]李勇,何生虎,張永康.披針葉黃華生物堿的提取及對小鼠的急性毒理試驗[J].動物毒物學(xué)，2006，1-2（44）

[7]王捷,梁震,劉瑛.急性毒性LD50實驗研究的進展[J].農(nóng)藥，2000，39（5）45-46

[8]張宏利,楊清娥,楊學(xué)軍等.苦參堿的提取分離及對小鼠的毒性研究[J].西北植物學(xué)報，2005，25（8）：1649-1652

[9]董強,趙寶玉,陳紹淑等.牛心樸子總生物堿對小鼠的毒性試驗[J].中國獸醫(yī)雜志，2004，40（1）：25-26

[10]郎景華,丁振鐸,仇波等.瘟疫消散劑的動物急性毒性和長期毒性的研究[J].畜牧獸醫(yī)科技信息2007.5，86-87