不同水稻受體材料對(duì)潔凈DNA轉(zhuǎn)化效率的影響

摘要：選取不同誘導(dǎo)條件（28 ℃光照、28 ℃黑暗、32 ℃光照、32 ℃黑暗），不同繼代次數(shù)初代培養(yǎng)、1次繼代培養(yǎng)、2次繼代培養(yǎng)的愈傷組織，分別作為轉(zhuǎn)化受體材料，研究不同受體材料對(duì)潔凈DNA轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明，32 ℃光培養(yǎng)誘導(dǎo)的愈傷經(jīng)過(guò)1次繼代后作為轉(zhuǎn)化受體材料，得到的轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到9.32%。

關(guān)鍵詞：水稻；受體材料；潔凈DNA轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化效率

中圖分類(lèi)號(hào)： Q943；S511.03文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）06-0043-04

收稿日期：2013-09-11

基金項(xiàng)目：浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研課題（編號(hào)：13QN08）。

作者簡(jiǎn)介：趙瀟（1987—），女，浙江東陽(yáng)人，碩士研究生，助教，主要從事植物基因工程與分子生物學(xué)研究。Tel：（0571）86929740；E-mail：zhaoxiao413@126.com。 傳統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化中，普遍使用完整質(zhì)粒DNA，非目的基因的質(zhì)粒載體主干序列經(jīng)常隨著目的基因整合到植物基因組中，并通過(guò)形成穩(wěn)定的次級(jí)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生重組熱點(diǎn)或?qū)е庐惓Ｖ亟M，重組產(chǎn)生的基因多拷貝經(jīng)常導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因的低表達(dá)甚至基因沉默[1]?；驑尳閷?dǎo)的潔凈DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)是直接將外源基因表達(dá)框線性DNA導(dǎo)入植物基因組中，所得不含非目的基因的DNA序列，獲得安全的轉(zhuǎn)基因植株[2]。基因槍轉(zhuǎn)化的受體材料，所處的生理狀態(tài)不同，接受外源DNA的能力也不同。一般認(rèn)為生理活性高的組織或細(xì)胞有利于DNA的攝入與整合[3]。選用再生能力強(qiáng)的外植體為轉(zhuǎn)化受體，將有利于轉(zhuǎn)化頻率的提高。本研究主要選取不同誘導(dǎo)條件，不同繼代次數(shù)的愈傷組織，分別作為轉(zhuǎn)化受體材料，將含bar基因的表達(dá)框，通過(guò)基因槍法導(dǎo)入水稻，以期明確不同水稻受體材料對(duì)潔凈DNA轉(zhuǎn)化效率的影響。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為粳稻日本晴，由中國(guó)水稻研究所水稻生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室種質(zhì)創(chuàng)新課題組提供。

1.2基因

含有bar基因的載體質(zhì)粒為pCB1，pCB1質(zhì)粒菌保由中國(guó)水稻研究所水稻生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室種質(zhì)創(chuàng)新課題組提供。pCB1質(zhì)粒大小為6.91 kb，結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1.3培養(yǎng)基

試驗(yàn)中所需的培養(yǎng)基見(jiàn)表1。

1.4水稻愈傷組織誘導(dǎo)

1.4.1不同條件下誘導(dǎo)的愈傷組織挑選籽粒飽滿的日本晴成熟種子，粗糙去殼，再挑選胚完整而無(wú)裂紋的種子，用70%的乙醇浸泡60 s，再用體積分?jǐn)?shù)30%次氯酸鈉溶液（有效氯≥5%）中浸泡15 min，重復(fù)該操作1次，用無(wú)菌水沖洗 3～5 次，再將種子置于滅菌的墊有濾紙的培養(yǎng)皿中于超凈臺(tái)上吹干，然后接入NB培養(yǎng)基中，在28 ℃光照、28 ℃黑暗、32 ℃ 光照、32 ℃黑暗4種條件下誘導(dǎo)愈傷。待長(zhǎng)出可見(jiàn)的芽和愈傷后，將芽掐掉，愈傷朝上繼續(xù)培養(yǎng)2周，2周之后，將有活力的愈傷移入新NB誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)15 d，15 d后挑出顏色鮮黃、表面光滑，直徑大小約為3 mm左右的愈傷組織顆粒，作為基因槍轉(zhuǎn)化的受體材料。

1.4.2不同繼代次數(shù)的愈傷組織挑選籽粒飽滿的日本晴成熟種子，粗糙去殼，再挑選胚完整而無(wú)裂紋的種子，用70%的乙醇浸泡60 s，再用體積分?jǐn)?shù)30%次氯酸鈉溶液（有效氯≥5%）中浸泡15 min，重復(fù)該操作1次，用無(wú)菌水沖洗3～5次，再將種子置于滅菌的墊有濾紙的培養(yǎng)皿中于超凈臺(tái)上吹干，然后接入NB培養(yǎng)基中，在32 ℃光照條件下誘導(dǎo)愈傷。待長(zhǎng)出可見(jiàn)的芽和愈傷后，將芽掐掉，愈傷朝上繼續(xù)培養(yǎng)2

表1水稻組織培養(yǎng)基

培養(yǎng)基成分誘導(dǎo)、繼代NB培養(yǎng)基+2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸 pH值5.8預(yù)分化培養(yǎng)基NB基本培養(yǎng)基+5 mg/L 脫落酸+2 mg/L 6-芐氨基嘌呤+0.5 mg/L 萘乙酸 pH值5.8分化培養(yǎng)基NB基本培養(yǎng)基+3 mg/L 6-芐氨基嘌呤+0.5 mg/L 萘乙酸+13g/L山梨醇+50 mg/L羧芐青霉素 pH值5.8生根培養(yǎng)基1/2MS基本培養(yǎng)基+20 g/L蔗糖+2mg/ml 多效唑 pH值5.8MS大量、MS微量、B5有機(jī)、Fe-EDTA、30 g/L蔗糖MS基本培養(yǎng)基2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、300 mg/L水解酪蛋白、100 mg/L 肌醇3 g/L植物凝膠 pH值5.8高滲培養(yǎng)基NB培養(yǎng)基+2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+47 g/L甘露醇+47 g/L山梨醇 pH值5.8

周之后，將愈傷組織等分為3組，從1組中挑出顏色鮮黃、表面光滑、直徑大小約為3 mm左右的愈傷組織顆粒，直接作為基因槍轉(zhuǎn)化的受體材料。其余2組移入新的NB誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)。15 d后，將繼代培養(yǎng)的愈傷組織分為2組，1組進(jìn)行第2次繼代，另一組中挑取顏色鮮黃、有活力的愈傷組織進(jìn)行基因槍轟擊。2周后，從經(jīng)過(guò)2次繼代培養(yǎng)的愈傷組織中挑出合適的愈傷組織顆粒，作為基因槍轉(zhuǎn)化的受體材料。

1.5潔凈DNA轉(zhuǎn)化

1.5.1質(zhì)粒提取pCB1質(zhì)粒提取方法采用傳統(tǒng)的堿裂解法。

1.5.2bar基因表達(dá)框回收根據(jù)圖1，用PstⅠ和BssHⅠ雙酶切質(zhì)粒pCB1產(chǎn)生1.61 kb的bar基因表達(dá)框。參照TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0試劑盒回收目的片段。

1.5.3基因槍轉(zhuǎn)化參照Weeks等的方法[4]制備金粉微彈懸液，以1 mg/mL魚(yú)精蛋白作為DNA沉淀劑，轟擊時(shí)氦氣壓力為7.59 MPa，轟擊距離為5 cm，進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化。

1.6愈傷組織分化、幼苗生根及移栽

將經(jīng)過(guò)基因槍轟擊的愈傷組織轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后，轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，每個(gè)分化瓶放置1顆愈傷，待長(zhǎng)出綠苗至6～7 cm時(shí)轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上生根，待根系生長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，移出培養(yǎng)瓶，用清水沖洗植株及根上黏附的培養(yǎng)基，隨后移入轉(zhuǎn)基因苗圃中。

1.7轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

按Edwards等的方法[5]提取待測(cè)的葉片總DNA。PCR體系為20 μL，包括1.0 μL 模板，0.2 μL Taq酶，2.0 μL dNTPs（2.5 mmol/L），2.0 μL 10×緩沖液，1 μL引物1（10 μmol/L），1 μL 引物2（10 μmol/L），9.8 μL 雙蒸水。bar基因引物P1序列為5′-CAGGAACCGCAGGAGTGGA-3′；引物P2序列為5′-CCAGAAACCCACGTCATGCC-3′；可擴(kuò)增出大小372 bp的DNA特異性片段。PCR反應(yīng)參數(shù)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1.5 min，72 ℃ 延伸 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)采用1%的瓊脂糖凝膠，將PCR擴(kuò)增體系加以體積比為 10 ∶1 的溴酚藍(lán)上樣電泳，EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描成像觀察記錄圖片結(jié)果。

1.8轉(zhuǎn)基因植株的抗性鑒定

轉(zhuǎn)基因植株移栽到大田中，存活后用0.32% Basta涂抹葉片，7 d后統(tǒng)計(jì)檢測(cè)植株對(duì)除草劑抗性。

1.9數(shù)據(jù)處理

綠苗分化率=分化綠苗數(shù)/轟擊愈傷組織數(shù)×100%；

陽(yáng)性植株率=PCR陽(yáng)性植株數(shù)/綠苗數(shù)×100%；

轉(zhuǎn)化率=PCR陽(yáng)性植株株數(shù)/轟擊愈傷組織數(shù)×100%。

每個(gè)處理重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，采用t檢驗(yàn)比較處理與對(duì)照的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)基因水稻植株的PCR檢測(cè)結(jié)果

利用bar基因序列設(shè)計(jì)引物對(duì)bar基因表達(dá)框轉(zhuǎn)化的水稻陽(yáng)性植株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，以pCB1質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照株及未轉(zhuǎn)化日本晴基因組DNA為陰性對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖2）。

2.2不同誘導(dǎo)條件培養(yǎng)的愈傷組織對(duì)潔凈DNA轉(zhuǎn)化效率的影響

4種不同條件下誘導(dǎo)出的愈傷組織作為基因槍轉(zhuǎn)化的受體材料，對(duì)潔凈DNA轉(zhuǎn)化率的影響結(jié)果見(jiàn)表2、圖3。從表2中可知，溫度和光照條件都能影響水稻植株綠苗分化率、陽(yáng)性植株率和轉(zhuǎn)化率的改變。以28 ℃黑暗處理為對(duì)照組，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，32 ℃光照條件下誘導(dǎo)的愈傷最終綠苗分化率極顯著提高，轉(zhuǎn)化率顯著提高。在溫度相同的條件下，光培養(yǎng)的愈傷

表2不同誘導(dǎo)條件下獲得的水稻愈傷組織對(duì)潔凈DNA轉(zhuǎn)化率的影響

誘導(dǎo)條件重復(fù)轟擊愈傷數(shù)

（個(gè)）綠苗數(shù)

（株）PCR陽(yáng)性植株數(shù)

（株）綠苗分化率

（%）陽(yáng)性植株率

（%）轉(zhuǎn)化率

（%）32 ℃光照Ⅰ5820534.48258.62Ⅱ5818531.0327.788.62Ⅲ5618632.1433.3310.71x±s57.33±1.1518.67±1.155.33±0.5832.55±0.02**28.70±0.049.32±0.01*32 ℃黑暗Ⅰ5814424.1428.576.90Ⅱ5714324.5621.435.26Ⅲ5915425.4226.676.78x±s58.00±1.0014.33±0.583.67±0.5824.71±0.0125.56±0.046.31±0.0128 ℃光照Ⅰ5815525.8633.338.62Ⅱ6015425.0026.676.67Ⅲ5816427.5925.006.90x±s58.67±1.1515.33±0.584.33±0.5826.15±0.0128.33±0.047.39±0.0128 ℃黑暗Ⅰ5715426.3226.677.02Ⅱ6013321.6723.085.00Ⅲ5814424.1428.576.90x±s58.33±1.5314.00±1.003.67±0.5824.04±0.0226.00±0.036.30±0.01注：**表示差異極顯著（P<0.01）；*表示差異顯著（P<0.05）。表3同。

組織、長(zhǎng)苗后綠苗分化率和陽(yáng)性植株率都高于暗培養(yǎng)處理。在32 ℃光照誘導(dǎo)下的愈傷，經(jīng)1次繼代培養(yǎng)后，作為基因槍轟擊材料，最終所得的綠苗分化率為32.55%，陽(yáng)性植株率為28.70%，轉(zhuǎn)化率為9.32%，是3個(gè)處理組中最高的。表明綠苗分化率的提高在一定程度上促進(jìn)了陽(yáng)性植株率的提高，陽(yáng)性植株率的提高促進(jìn)了最終轉(zhuǎn)化率的提高。

從圖3可知，32 ℃光照培養(yǎng)的條件下，水稻植株的轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到9.32%，28 ℃光照條件下轉(zhuǎn)化率為7.39%，32 ℃黑暗條件下轉(zhuǎn)化率為6.31%，28 ℃黑暗條件下轉(zhuǎn)化率最小，只有6.30%，在黑暗條件誘導(dǎo)時(shí)，最終轉(zhuǎn)化率很接近。表明用潔凈DNA技術(shù)轉(zhuǎn)化水稻時(shí)，32 ℃ 光照條件下誘導(dǎo)的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化的受體材料，轉(zhuǎn)化率最高。

2.3不同繼代次數(shù)的愈傷組織對(duì)潔凈DNA轉(zhuǎn)化效率的影響

3種不同時(shí)期的愈傷組織作為基因槍轉(zhuǎn)化的受體材料，對(duì)潔凈DNA轉(zhuǎn)化率的影響結(jié)果見(jiàn)表3。從表3中可知，不同繼代次數(shù)的愈傷組織作為受體材料，最終所得的水稻植株綠苗分化率、陽(yáng)性植株率和轉(zhuǎn)化率都不相同。以初代培養(yǎng)的愈傷組織作為對(duì)照組進(jìn)行t檢驗(yàn)，經(jīng)1次繼代培養(yǎng)后，綠苗分化率得到極顯著提高，達(dá)到32.55%，經(jīng)2次培養(yǎng)后，綠苗分化率顯著降低，僅有21.91%；經(jīng)1次繼代培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)化率也得到顯著提高。

從表3還可知，1次繼代培養(yǎng)的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體材料，水稻植株的轉(zhuǎn)化率最高，為9.32%，其次是初代培養(yǎng)，為575%，而2次繼代培養(yǎng)的愈傷組織作為轟擊材料得到的轉(zhuǎn)化率最低，只有3.57%。表明經(jīng)過(guò)1次繼代培養(yǎng)的愈傷組織作為基因槍轉(zhuǎn)化的受體材料，進(jìn)行潔凈DNA轉(zhuǎn)化時(shí)轉(zhuǎn)化率最高。

2.4植株抗性鑒定

將PCR檢測(cè)陽(yáng)性植株移栽至大田，成活之后對(duì)陽(yáng)性植株進(jìn)行抗除草劑試驗(yàn)，即在水稻植株葉片上涂抹0.32%的 Basta 溶液，7 d后統(tǒng)計(jì)成活情況。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的葉片及整株均不受影響，而非轉(zhuǎn)基因植株的葉片變褐枯死（圖4）。表明轉(zhuǎn)基因植株具有對(duì)Basta 的抗性。表3不同時(shí)期愈傷組織對(duì)潔凈DNA轉(zhuǎn)化的影響

愈傷時(shí)期重復(fù)轟擊愈傷數(shù)

（個(gè)）綠苗數(shù)

（株）PCR陽(yáng)性植株數(shù)

（株）綠苗分化率

（%）陽(yáng)性植株率

（%）轉(zhuǎn)化率

（%）初代培養(yǎng)Ⅰ6015225.0013.333.33Ⅱ5815425.8626.676.90Ⅲ5714424.5628.577.02x±s58.33±1.5314.67±0.583.33±1.1525.14±0.0122.86±0.085.75±0.021次繼代培養(yǎng)Ⅰ5820534.4825.008.62Ⅱ5818531.0327.788.62Ⅲ5618632.1433.3310.71x±s57.33±1.1518.67±1.155.33±0.5832.55±0.02**28.70±0.049.32±0.01*2次繼代培養(yǎng)Ⅰ5513323.6423.085.45Ⅱ5712121.058.331.75Ⅲ5712221.0516.673.51x±s56.33±1.1512.33±0.582.00±1.0021.91±0.01*16.03±0.073.57±0.02

3討論

基因槍轉(zhuǎn)化過(guò)程中，通常選用生理活性高、再生能力強(qiáng)的外植體作為轉(zhuǎn)化受體，有利于轉(zhuǎn)化率的提高。本研究中選用成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體材料，轉(zhuǎn)化率比幼胚會(huì)相對(duì)偏低，愈傷在培養(yǎng)過(guò)程中易褐化。針對(duì)上述問(wèn)題，應(yīng)嚴(yán)格注意成熟胚誘導(dǎo)愈傷過(guò)程，盡可能在短期內(nèi)完成誘導(dǎo)過(guò)程，減少愈傷的褐化率。

Toki認(rèn)為溫度控制在32 ℃可以有效提高酶的活性，加快愈傷組織的生長(zhǎng)[6]。劉萍等將春小麥在32 ℃條件下誘導(dǎo)，出愈率也普遍提高[7]。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)論一致。選擇在32 ℃條件下誘導(dǎo)，可以使水稻愈傷組織生長(zhǎng)迅速，可以保證酶活，使其本身處于較高活性狀態(tài)，間接促進(jìn)水稻植株轉(zhuǎn)化率的提高。在誘導(dǎo)愈傷時(shí)，光照能有效調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化狀態(tài)，促進(jìn)愈傷誘導(dǎo)，愈傷誘導(dǎo)率明顯高于暗培養(yǎng)，光培養(yǎng)能大大縮短誘導(dǎo)愈傷的周期，減少愈傷組織褐化率，間接促進(jìn)轉(zhuǎn)化率的提高。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)1次繼代培養(yǎng)后的愈傷組織作為基因槍轉(zhuǎn)化的受體材料所得轉(zhuǎn)化率最高，胡張華等的研究結(jié)果[8]一致。因?yàn)樵诔醮囵B(yǎng)時(shí)期，許多細(xì)胞分裂剛處于分裂初期，活力不夠旺盛，并不是T-DNA整合攝入的最適宜時(shí)期。經(jīng)過(guò)2次繼代的愈傷組織，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，褐化率明顯增加，細(xì)胞活力和分裂能力也開(kāi)始下降，不利于T-DNA的整合攝入。經(jīng)過(guò)1次繼代的愈傷組織，生理活性和再生能力都處于最佳狀態(tài)，細(xì)胞分裂旺盛，能夠承受基因槍轟擊并且易于接受轉(zhuǎn)化。

本試驗(yàn)結(jié)果以成熟的粳稻品種為水稻材料，在32 ℃光照條件下誘導(dǎo)愈傷，然后經(jīng)過(guò)1次繼代培養(yǎng)的愈傷組織，作為基因槍轉(zhuǎn)化的受體材料，對(duì)潔凈DNA轉(zhuǎn)化效率最高。

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愈傷時(shí)期重復(fù)轟擊愈傷數(shù)

（個(gè)）綠苗數(shù)

（株）PCR陽(yáng)性植株數(shù)

（株）綠苗分化率

（%）陽(yáng)性植株率

（%）轉(zhuǎn)化率

（%）初代培養(yǎng)Ⅰ6015225.0013.333.33Ⅱ5815425.8626.676.90Ⅲ5714424.5628.577.02x±s58.33±1.5314.67±0.583.33±1.1525.14±0.0122.86±0.085.75±0.021次繼代培養(yǎng)Ⅰ5820534.4825.008.62Ⅱ5818531.0327.788.62Ⅲ5618632.1433.3310.71x±s57.33±1.1518.67±1.155.33±0.5832.55±0.02**28.70±0.049.32±0.01*2次繼代培養(yǎng)Ⅰ5513323.6423.085.45Ⅱ5712121.058.331.75Ⅲ5712221.0516.673.51x±s56.33±1.1512.33±0.582.00±1.0021.91±0.01*16.03±0.073.57±0.02

3討論

基因槍轉(zhuǎn)化過(guò)程中，通常選用生理活性高、再生能力強(qiáng)的外植體作為轉(zhuǎn)化受體，有利于轉(zhuǎn)化率的提高。本研究中選用成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體材料，轉(zhuǎn)化率比幼胚會(huì)相對(duì)偏低，愈傷在培養(yǎng)過(guò)程中易褐化。針對(duì)上述問(wèn)題，應(yīng)嚴(yán)格注意成熟胚誘導(dǎo)愈傷過(guò)程，盡可能在短期內(nèi)完成誘導(dǎo)過(guò)程，減少愈傷的褐化率。

Toki認(rèn)為溫度控制在32 ℃可以有效提高酶的活性，加快愈傷組織的生長(zhǎng)[6]。劉萍等將春小麥在32 ℃條件下誘導(dǎo)，出愈率也普遍提高[7]。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)論一致。選擇在32 ℃條件下誘導(dǎo)，可以使水稻愈傷組織生長(zhǎng)迅速，可以保證酶活，使其本身處于較高活性狀態(tài)，間接促進(jìn)水稻植株轉(zhuǎn)化率的提高。在誘導(dǎo)愈傷時(shí)，光照能有效調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化狀態(tài)，促進(jìn)愈傷誘導(dǎo)，愈傷誘導(dǎo)率明顯高于暗培養(yǎng)，光培養(yǎng)能大大縮短誘導(dǎo)愈傷的周期，減少愈傷組織褐化率，間接促進(jìn)轉(zhuǎn)化率的提高。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)1次繼代培養(yǎng)后的愈傷組織作為基因槍轉(zhuǎn)化的受體材料所得轉(zhuǎn)化率最高，胡張華等的研究結(jié)果[8]一致。因?yàn)樵诔醮囵B(yǎng)時(shí)期，許多細(xì)胞分裂剛處于分裂初期，活力不夠旺盛，并不是T-DNA整合攝入的最適宜時(shí)期。經(jīng)過(guò)2次繼代的愈傷組織，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，褐化率明顯增加，細(xì)胞活力和分裂能力也開(kāi)始下降，不利于T-DNA的整合攝入。經(jīng)過(guò)1次繼代的愈傷組織，生理活性和再生能力都處于最佳狀態(tài)，細(xì)胞分裂旺盛，能夠承受基因槍轟擊并且易于接受轉(zhuǎn)化。

本試驗(yàn)結(jié)果以成熟的粳稻品種為水稻材料，在32 ℃光照條件下誘導(dǎo)愈傷，然后經(jīng)過(guò)1次繼代培養(yǎng)的愈傷組織，作為基因槍轉(zhuǎn)化的受體材料，對(duì)潔凈DNA轉(zhuǎn)化效率最高。

參考文獻(xiàn)：

[1]辛翠花，劉慶昌，屈冬玉，等. 無(wú)選擇標(biāo)記的植物表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2008，35（5）：701-706.

[2]Fu X，Duc L T，F(xiàn)ontana S，et al. Linear transgene constructs lacking vector backbone sequences generate low-copy-number transgenic plants with simple integration patterns[J]. Transgenic Research，2000，9（1）：11-19.

[3]楊?lèi)?ài)馥，蘇喬，安利佳. 利用子房滴注法獲得無(wú)載體骨架序列和選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因玉米[J]. 遺傳，2009，31（1）：95-100.

[4]Weeks T，Anderson O D，Blechl A. Rapid praduction of multiple independent lines of fertile transgenic wheat（Triticum aestivum L.）[J]. Plant Physiol，1994，5：299-307.

[5]Edwards K，Johnstone C，Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis[J]. Nucleic Acids Res，1991，19（6）：1349.

[6]Toki S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice[J]. Plant Molecular Biology Reporter，1997，15：16-21.

[7]劉萍，宋曉華，馬惠萍，等. 溫度處理對(duì)春小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)率影響初報(bào)[J]. 寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1996，17（1）：52-56.

[8]胡張華，劉智宏，郎春秀，等. 影響大豆基因槍轉(zhuǎn)化的幾個(gè)參數(shù)[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1999，11（5）：26-28.張羽. 分子標(biāo)記技術(shù)的產(chǎn)生與引物設(shè)計(jì)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：47-51.

愈傷時(shí)期重復(fù)轟擊愈傷數(shù)

（個(gè)）綠苗數(shù)

（株）PCR陽(yáng)性植株數(shù)

（株）綠苗分化率

（%）陽(yáng)性植株率

（%）轉(zhuǎn)化率

（%）初代培養(yǎng)Ⅰ6015225.0013.333.33Ⅱ5815425.8626.676.90Ⅲ5714424.5628.577.02x±s58.33±1.5314.67±0.583.33±1.1525.14±0.0122.86±0.085.75±0.021次繼代培養(yǎng)Ⅰ5820534.4825.008.62Ⅱ5818531.0327.788.62Ⅲ5618632.1433.3310.71x±s57.33±1.1518.67±1.155.33±0.5832.55±0.02**28.70±0.049.32±0.01*2次繼代培養(yǎng)Ⅰ5513323.6423.085.45Ⅱ5712121.058.331.75Ⅲ5712221.0516.673.51x±s56.33±1.1512.33±0.582.00±1.0021.91±0.01*16.03±0.073.57±0.02

3討論

基因槍轉(zhuǎn)化過(guò)程中，通常選用生理活性高、再生能力強(qiáng)的外植體作為轉(zhuǎn)化受體，有利于轉(zhuǎn)化率的提高。本研究中選用成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體材料，轉(zhuǎn)化率比幼胚會(huì)相對(duì)偏低，愈傷在培養(yǎng)過(guò)程中易褐化。針對(duì)上述問(wèn)題，應(yīng)嚴(yán)格注意成熟胚誘導(dǎo)愈傷過(guò)程，盡可能在短期內(nèi)完成誘導(dǎo)過(guò)程，減少愈傷的褐化率。

Toki認(rèn)為溫度控制在32 ℃可以有效提高酶的活性，加快愈傷組織的生長(zhǎng)[6]。劉萍等將春小麥在32 ℃條件下誘導(dǎo)，出愈率也普遍提高[7]。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)論一致。選擇在32 ℃條件下誘導(dǎo)，可以使水稻愈傷組織生長(zhǎng)迅速，可以保證酶活，使其本身處于較高活性狀態(tài)，間接促進(jìn)水稻植株轉(zhuǎn)化率的提高。在誘導(dǎo)愈傷時(shí)，光照能有效調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化狀態(tài)，促進(jìn)愈傷誘導(dǎo)，愈傷誘導(dǎo)率明顯高于暗培養(yǎng)，光培養(yǎng)能大大縮短誘導(dǎo)愈傷的周期，減少愈傷組織褐化率，間接促進(jìn)轉(zhuǎn)化率的提高。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)1次繼代培養(yǎng)后的愈傷組織作為基因槍轉(zhuǎn)化的受體材料所得轉(zhuǎn)化率最高，胡張華等的研究結(jié)果[8]一致。因?yàn)樵诔醮囵B(yǎng)時(shí)期，許多細(xì)胞分裂剛處于分裂初期，活力不夠旺盛，并不是T-DNA整合攝入的最適宜時(shí)期。經(jīng)過(guò)2次繼代的愈傷組織，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，褐化率明顯增加，細(xì)胞活力和分裂能力也開(kāi)始下降，不利于T-DNA的整合攝入。經(jīng)過(guò)1次繼代的愈傷組織，生理活性和再生能力都處于最佳狀態(tài)，細(xì)胞分裂旺盛，能夠承受基因槍轟擊并且易于接受轉(zhuǎn)化。

本試驗(yàn)結(jié)果以成熟的粳稻品種為水稻材料，在32 ℃光照條件下誘導(dǎo)愈傷，然后經(jīng)過(guò)1次繼代培養(yǎng)的愈傷組織，作為基因槍轉(zhuǎn)化的受體材料，對(duì)潔凈DNA轉(zhuǎn)化效率最高。

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[6]Toki S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice[J]. Plant Molecular Biology Reporter，1997，15：16-21.

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[8]胡張華，劉智宏，郎春秀，等. 影響大豆基因槍轉(zhuǎn)化的幾個(gè)參數(shù)[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1999，11（5）：26-28.張羽. 分子標(biāo)記技術(shù)的產(chǎn)生與引物設(shè)計(jì)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：47-51.