李娜+張保平+王文彬+等

摘要：采集湖南省常德地區(qū)3個雞場病料105份，并采用玻板凝集法進行了O抗原血清型鑒定。結果發(fā)現(xiàn)，105份雞場病料經(jīng)分離鑒定出致病性大腸桿菌60株，30株鑒定出抗O血清型。該地區(qū)流行優(yōu)勢血清型為O55（5株）、O111（9株）、O78（15株），分別占16.67%、30%、50%。3種優(yōu)勢血清型占總定型菌株的96.67%（29/30）。

關鍵詞：雞；致病性大腸桿菌；血清型

中圖分類號： S858.315.1+2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0171-02

收稿日期：2013-09-21

基金項目：湖南文理學院青年專項基金（編號：QNYX0811）；湖南省常德市指導性科技計劃（編號：2006ZD24）；湖南省“十二五”重點建設學科（動物學）項目（編號：湘教發(fā)[2011]76號）；湖南省高校科技創(chuàng)新團隊項目（編號：2008244）； 湖南省動物學重點實驗室項目（編號：200824632 ）。

作者簡介：李娜（1977—）女，吉林長春人，碩士，講師，研究方向為預防獸醫(yī)學。E-mail：vetlina@163.com。雞大腸埃希菌病是一種危害各年齡、各品種雞的傳染性疾病，其病原為大腸桿菌（Escherichia coli），具有多種血清型。該病的主要特征包括心包炎、肝周炎、臍炎、氣囊炎、敗血癥、眼炎、滑膜炎、卵黃性腹膜炎等，多繼發(fā)新城疫、傳染性喉氣管炎等疾病，導致雞群高死亡率，對雞養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)危害極大[1]。有關雞大腸桿菌病流行病學的研究，國內(nèi)已有很多報道，主要涉及我國的主要?。ㄊ小^(qū)），而對縣（市、區(qū)）研究得不多。由于大腸桿菌血清型多，抗原復雜，小區(qū)域之間也存在較大差異，為了能準確地防治雞大腸桿菌病，應在盡可能小的區(qū)域內(nèi)對其進行病原血清型調(diào)查，目前對常德及周邊區(qū)域雞場大腸桿菌的主要血清型分布情況的調(diào)查研究還未見報道。因此，筆者從2006年10月至2012年12月對湖南省常德地區(qū)的雞大腸桿菌病流行情況及血清型進行調(diào)查，查清本地的主要流行菌株，為疫苗研制和選用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料采集2006年10月至2012年12月期間，選取湖南省常德地區(qū)飼養(yǎng)的疑似大腸桿菌病雞的臟器105份，患病雞癥狀主要表現(xiàn)敗血癥、氣囊炎、心包炎、肝周炎、滑膜炎、輸卵管炎和眼炎等。無菌采集病死雞的心包、心血、肝、脾、氣管、腹水和卵黃囊內(nèi)明顯病變的組織。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑普通瓊脂平板培養(yǎng)基、三糖鐵（TSI）瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭（EMB）瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱（MAC）瓊脂培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術責任有限公司；生化試驗微量發(fā)酵管購自浙江省杭州微生物試劑有限公司；腸道致病性大腸桿菌診斷血清（含15種血清型），購自浙江省寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；普通營養(yǎng)肉湯為自制。

1.1.3試驗動物18～25 g小白鼠，購自湖南農(nóng)業(yè)大學小動物室。

1.2方法

1.2.1細菌形態(tài)與分離培養(yǎng)將新鮮采集的病料劃線接種于普通培養(yǎng)基、MAC培養(yǎng)基、 EMB培養(yǎng)基上和穿刺TSI瓊脂管，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h后觀察，挑取疑似的單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢，將培養(yǎng)特性及形態(tài)、染色反應、排列均符合大腸桿菌的菌株劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板進行細菌的數(shù)次純化，然后將純化好的細菌接種于普通斜面培養(yǎng)基上4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2生化特性鑒定將分離的60個菌株接種普通肉湯，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24～48 h后適量接種于葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、棉子糖、尿素、H2S、靛基質(zhì)、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、MR、VP微量發(fā)酵管，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后觀察生化反應結果。靛基質(zhì)滴加靛基質(zhì)試劑，MR滴加MR試劑1滴即刻觀察結果；VP滴加VP甲液2滴、VP乙液1滴，置于37 ℃培養(yǎng)2 h后觀察結果。

1.2.3大腸埃希菌致病性試驗取已鑒定出生化反應符合大腸桿菌的菌株的37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18 h的普通肉湯培養(yǎng)物（菌液濃度為30億CFU/mL），經(jīng)純粹檢驗合格，分別腹腔接種18～25 g小白鼠，按0.2 mL/只劑量接種，每個菌株接種6只，對照組經(jīng)相同的途徑接種0.2 mL普通肉湯培養(yǎng)液，接種6只。接種后飼養(yǎng)觀察存活情況120 h，記錄小白鼠的死亡時間并對死亡的小白鼠剖檢取其肝臟、心臟后，用EMB平板進行接種菌回收試驗以分離致病菌。

1.2.4分離菌O血清型鑒定將以上鑒定出的致病性大腸桿菌接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，分別用2 mL 0.5%石炭酸生理鹽水清洗，置小圓底試管中，制成濃稠的菌懸液，然后與普通肉湯培養(yǎng)物一起于121.3 ℃下高壓處理2 h，破壞其K抗原制成高壓抗原，進行O抗原的鑒定。將每個分離菌株的菌懸液與大腸桿菌標準O抗原單因子血清置于潔凈的玻板上混勻，1～2 min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集顆粒者為陽性反應，初步篩選可能的O血清型，然后再用試管凝集試驗確定O血清型。每次試驗同時以高壓抗原與0.5%石炭酸生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝現(xiàn)象。具體判定按照腸道致病性大腸桿菌診斷血清（含15種血清型）使用說明書中標準檢測所有細菌分離株的大腸桿菌血清型。

2結果與分析

2.1細菌形態(tài)及生長情況

在普通營養(yǎng)瓊脂平板上菌落生長良好，濕潤，呈現(xiàn)半透明狀態(tài)，灰白色，邊緣光滑；在EMB瓊脂培養(yǎng)基平板上形成中等大小、邊緣整齊、表面光滑、黑紫色帶金屬光澤的菌落；在MAC瓊脂培養(yǎng)基平板上長出圓形粉紅色、表面光滑、圓形、中等大小的菌落；TSI管底及斜面均變?yōu)辄S色、產(chǎn)氣不產(chǎn)H2S；經(jīng)過革蘭氏染色鏡檢后，鏡下均可見大量散在的紅色、中等大小、兩端鈍圓的無芽孢G-短小直桿菌。

2.2分離菌的生化特性

對分離出的60株細菌分別進行生化試驗，結果均符合大腸桿菌的生化特性。

雞大腸桿菌地方分離株的生化試驗結果

項目結果MR+VP-乳糖+蔗糖-葡萄糖+麥芽糖+棉子糖-甘露醇+尿素-靛基質(zhì)﹢H2S﹢賴氨酸﹢鳥氨酸﹢注：“+”表示陽性，“-”表示陰性。

2.3大腸桿菌致病性試驗

接種分離菌的小白鼠12 h后均出現(xiàn)精神不振，18 h開始出現(xiàn)死亡，48 h全部死亡。剖檢死亡的小白鼠可見肝臟腫大淤血，表面散在針尖大小的出血點，心包膜、腹膜、肺、腎、脾臟均有不同程度的出血。從死亡小白鼠的肝臟、心臟中均可分離到分離菌。對照組小白鼠健康活潑。分離菌的培養(yǎng)特性、形態(tài)、染色反應均符合大腸桿菌特性的菌株，即確定為致病性大腸桿菌。

2.4分離菌O血清型鑒定結果

從病雞、死雞雞場中采集的雞中分別分離出疑似大腸桿菌60株，用大腸桿菌O抗原定型血清對分離的60株大腸桿菌進行O型鑒定。經(jīng)玻板凝集鑒定，有30株致病性大腸桿菌鑒定出了血清型，其余30株沒有定型。30株致病性大腸桿菌血清型O抗原種類及來源分布見表2。其中O55、O111、O78株為優(yōu)勢血清型，共29株，占定型菌株的9667%，分布為O55共5株，O111共9株，O78 共15株，此外還鑒定出了1株O127a血清型。

3結論

本試驗分離的60株細菌的革蘭氏染色涂片及瑞氏染色涂片中細菌的形態(tài)特征皆與雞大腸桿菌的形態(tài)特征一致，60株細菌的生化試驗結果一致，且與雞大腸桿菌的生化特征一

對常德地區(qū)分離到的60株雞致病性大腸桿菌的血清型鑒定結果表明，雞場中致病性大腸桿菌有30株可量定其血清型，分屬4種O抗原血清型，其中O55（5株）占鑒定菌株的16.67%（雞場1占40%，雞場2占60%，雞場3未檢測到該血清型菌株），O111（9株）占鑒定菌株的30%（雞場1占4444%，雞場2占33.33%，雞場3占22.22%），O78（15株）占鑒定菌株的50%（雞場1占46.67%，雞場2占20.00%，雞場3占33.33%），此外還分離到1株血清型為O127a（雞場1占100%，雞場2和雞場3均未檢測到該血清型菌株）。

有關致病性大腸桿菌血清型鑒定國內(nèi)外報道較多，各地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型所占的比例相差比較大，但優(yōu)勢血清型均為O22、O1和O78[2]。本試驗所得4個血清型中O78的菌株最多，有15株，占定型菌株的50%，為最主要的優(yōu)勢血清型；另外2種優(yōu)勢血清型（O55和O111）則不在此列。本研究獲得的優(yōu)勢血清型種類與國內(nèi)魏麟等研究報道的湖南西部地區(qū)優(yōu)勢血清型種類[3]不同。說明我國雞大腸桿菌血清型分布存在著復雜性和多樣性。此外，在常德地區(qū)雞場1分離到1株O127a血清型的致病性大腸埃希菌，這在其他地區(qū)是比較少見的，可能與引種范圍比較廣有關，因此在大腸桿菌的防治上應引起重視。

目前由于雞源大腸桿菌不同血清型菌株之間缺乏完全保護，菌株之間的免疫原性也存在差異，而菌株的免疫原性又是由菌體的多種成分決定，因此到目前為止仍未找到一種理想的疫苗能對不同菌株進行免疫保護[4]。對于該病流行的雞場，采用本地（場）菌株制造的滅活疫苗或用大腸桿菌多價疫苗進行免疫，可以起到較好的效果。從健康高免雞血清中獲得的免疫球蛋白制劑可提高雞的抗病能力，對雞有保護作用。

參考文獻：

[1]劉觀忠，趙超，董修建.“痢得?！睂Φ坝秒r雞大腸桿菌病的治療效果及作用機理研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012，上（11）：145-147.

[2]張春榮，蘇亞拉圖. 我國流行的雞致病性大腸桿菌血清型[J]. 中國動物檢疫，1996，13（1）：2-8.

[3]魏麟，黎曉英，劉勝貴，等. 湖南西部地區(qū)雞大腸桿菌血清型分布及耐藥性分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37（28）：13615-13617.

[4]宋舟，陳偉，張立艷，等. 大腸桿菌外膜蛋白A研究進展[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（5）：199-202.黃其春，沈建勇. 焦米湯結合口服補液對初生仔豬細菌性腹瀉的治療效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（6）：173-174.

雞大腸桿菌地方分離株的生化試驗結果

項目結果MR+VP-乳糖+蔗糖-葡萄糖+麥芽糖+棉子糖-甘露醇+尿素-靛基質(zhì)﹢H2S﹢賴氨酸﹢鳥氨酸﹢注：“+”表示陽性，“-”表示陰性。

2.3大腸桿菌致病性試驗

接種分離菌的小白鼠12 h后均出現(xiàn)精神不振，18 h開始出現(xiàn)死亡，48 h全部死亡。剖檢死亡的小白鼠可見肝臟腫大淤血，表面散在針尖大小的出血點，心包膜、腹膜、肺、腎、脾臟均有不同程度的出血。從死亡小白鼠的肝臟、心臟中均可分離到分離菌。對照組小白鼠健康活潑。分離菌的培養(yǎng)特性、形態(tài)、染色反應均符合大腸桿菌特性的菌株，即確定為致病性大腸桿菌。

2.4分離菌O血清型鑒定結果

從病雞、死雞雞場中采集的雞中分別分離出疑似大腸桿菌60株，用大腸桿菌O抗原定型血清對分離的60株大腸桿菌進行O型鑒定。經(jīng)玻板凝集鑒定，有30株致病性大腸桿菌鑒定出了血清型，其余30株沒有定型。30株致病性大腸桿菌血清型O抗原種類及來源分布見表2。其中O55、O111、O78株為優(yōu)勢血清型，共29株，占定型菌株的9667%，分布為O55共5株，O111共9株，O78 共15株，此外還鑒定出了1株O127a血清型。

3結論

本試驗分離的60株細菌的革蘭氏染色涂片及瑞氏染色涂片中細菌的形態(tài)特征皆與雞大腸桿菌的形態(tài)特征一致，60株細菌的生化試驗結果一致，且與雞大腸桿菌的生化特征一

對常德地區(qū)分離到的60株雞致病性大腸桿菌的血清型鑒定結果表明，雞場中致病性大腸桿菌有30株可量定其血清型，分屬4種O抗原血清型，其中O55（5株）占鑒定菌株的16.67%（雞場1占40%，雞場2占60%，雞場3未檢測到該血清型菌株），O111（9株）占鑒定菌株的30%（雞場1占4444%，雞場2占33.33%，雞場3占22.22%），O78（15株）占鑒定菌株的50%（雞場1占46.67%，雞場2占20.00%，雞場3占33.33%），此外還分離到1株血清型為O127a（雞場1占100%，雞場2和雞場3均未檢測到該血清型菌株）。

有關致病性大腸桿菌血清型鑒定國內(nèi)外報道較多，各地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型所占的比例相差比較大，但優(yōu)勢血清型均為O22、O1和O78[2]。本試驗所得4個血清型中O78的菌株最多，有15株，占定型菌株的50%，為最主要的優(yōu)勢血清型；另外2種優(yōu)勢血清型（O55和O111）則不在此列。本研究獲得的優(yōu)勢血清型種類與國內(nèi)魏麟等研究報道的湖南西部地區(qū)優(yōu)勢血清型種類[3]不同。說明我國雞大腸桿菌血清型分布存在著復雜性和多樣性。此外，在常德地區(qū)雞場1分離到1株O127a血清型的致病性大腸埃希菌，這在其他地區(qū)是比較少見的，可能與引種范圍比較廣有關，因此在大腸桿菌的防治上應引起重視。

目前由于雞源大腸桿菌不同血清型菌株之間缺乏完全保護，菌株之間的免疫原性也存在差異，而菌株的免疫原性又是由菌體的多種成分決定，因此到目前為止仍未找到一種理想的疫苗能對不同菌株進行免疫保護[4]。對于該病流行的雞場，采用本地（場）菌株制造的滅活疫苗或用大腸桿菌多價疫苗進行免疫，可以起到較好的效果。從健康高免雞血清中獲得的免疫球蛋白制劑可提高雞的抗病能力，對雞有保護作用。

參考文獻：

[1]劉觀忠，趙超，董修建.“痢得?！睂Φ坝秒r雞大腸桿菌病的治療效果及作用機理研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012，上（11）：145-147.

[2]張春榮，蘇亞拉圖. 我國流行的雞致病性大腸桿菌血清型[J]. 中國動物檢疫，1996，13（1）：2-8.

[3]魏麟，黎曉英，劉勝貴，等. 湖南西部地區(qū)雞大腸桿菌血清型分布及耐藥性分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37（28）：13615-13617.

[4]宋舟，陳偉，張立艷，等. 大腸桿菌外膜蛋白A研究進展[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（5）：199-202.黃其春，沈建勇. 焦米湯結合口服補液對初生仔豬細菌性腹瀉的治療效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（6）：173-174.

雞大腸桿菌地方分離株的生化試驗結果

項目結果MR+VP-乳糖+蔗糖-葡萄糖+麥芽糖+棉子糖-甘露醇+尿素-靛基質(zhì)﹢H2S﹢賴氨酸﹢鳥氨酸﹢注：“+”表示陽性，“-”表示陰性。

2.3大腸桿菌致病性試驗

接種分離菌的小白鼠12 h后均出現(xiàn)精神不振，18 h開始出現(xiàn)死亡，48 h全部死亡。剖檢死亡的小白鼠可見肝臟腫大淤血，表面散在針尖大小的出血點，心包膜、腹膜、肺、腎、脾臟均有不同程度的出血。從死亡小白鼠的肝臟、心臟中均可分離到分離菌。對照組小白鼠健康活潑。分離菌的培養(yǎng)特性、形態(tài)、染色反應均符合大腸桿菌特性的菌株，即確定為致病性大腸桿菌。

2.4分離菌O血清型鑒定結果

從病雞、死雞雞場中采集的雞中分別分離出疑似大腸桿菌60株，用大腸桿菌O抗原定型血清對分離的60株大腸桿菌進行O型鑒定。經(jīng)玻板凝集鑒定，有30株致病性大腸桿菌鑒定出了血清型，其余30株沒有定型。30株致病性大腸桿菌血清型O抗原種類及來源分布見表2。其中O55、O111、O78株為優(yōu)勢血清型，共29株，占定型菌株的9667%，分布為O55共5株，O111共9株，O78 共15株，此外還鑒定出了1株O127a血清型。

3結論

本試驗分離的60株細菌的革蘭氏染色涂片及瑞氏染色涂片中細菌的形態(tài)特征皆與雞大腸桿菌的形態(tài)特征一致，60株細菌的生化試驗結果一致，且與雞大腸桿菌的生化特征一

對常德地區(qū)分離到的60株雞致病性大腸桿菌的血清型鑒定結果表明，雞場中致病性大腸桿菌有30株可量定其血清型，分屬4種O抗原血清型，其中O55（5株）占鑒定菌株的16.67%（雞場1占40%，雞場2占60%，雞場3未檢測到該血清型菌株），O111（9株）占鑒定菌株的30%（雞場1占4444%，雞場2占33.33%，雞場3占22.22%），O78（15株）占鑒定菌株的50%（雞場1占46.67%，雞場2占20.00%，雞場3占33.33%），此外還分離到1株血清型為O127a（雞場1占100%，雞場2和雞場3均未檢測到該血清型菌株）。

有關致病性大腸桿菌血清型鑒定國內(nèi)外報道較多，各地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型所占的比例相差比較大，但優(yōu)勢血清型均為O22、O1和O78[2]。本試驗所得4個血清型中O78的菌株最多，有15株，占定型菌株的50%，為最主要的優(yōu)勢血清型；另外2種優(yōu)勢血清型（O55和O111）則不在此列。本研究獲得的優(yōu)勢血清型種類與國內(nèi)魏麟等研究報道的湖南西部地區(qū)優(yōu)勢血清型種類[3]不同。說明我國雞大腸桿菌血清型分布存在著復雜性和多樣性。此外，在常德地區(qū)雞場1分離到1株O127a血清型的致病性大腸埃希菌，這在其他地區(qū)是比較少見的，可能與引種范圍比較廣有關，因此在大腸桿菌的防治上應引起重視。

目前由于雞源大腸桿菌不同血清型菌株之間缺乏完全保護，菌株之間的免疫原性也存在差異，而菌株的免疫原性又是由菌體的多種成分決定，因此到目前為止仍未找到一種理想的疫苗能對不同菌株進行免疫保護[4]。對于該病流行的雞場，采用本地（場）菌株制造的滅活疫苗或用大腸桿菌多價疫苗進行免疫，可以起到較好的效果。從健康高免雞血清中獲得的免疫球蛋白制劑可提高雞的抗病能力，對雞有保護作用。

參考文獻：

[1]劉觀忠，趙超，董修建.“痢得?！睂Φ坝秒r雞大腸桿菌病的治療效果及作用機理研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012，上（11）：145-147.

[2]張春榮，蘇亞拉圖. 我國流行的雞致病性大腸桿菌血清型[J]. 中國動物檢疫，1996，13（1）：2-8.

[3]魏麟，黎曉英，劉勝貴，等. 湖南西部地區(qū)雞大腸桿菌血清型分布及耐藥性分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37（28）：13615-13617.

[4]宋舟，陳偉，張立艷，等. 大腸桿菌外膜蛋白A研究進展[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（5）：199-202.黃其春，沈建勇. 焦米湯結合口服補液對初生仔豬細菌性腹瀉的治療效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（6）：173-174.