雙孢蘑菇疣孢霉菌形態(tài)特征及防治藥劑室內(nèi)毒力測(cè)定

謝春芹 陳嘯寅 楊鶴同 謝正林 陳藝

摘要：通過(guò)分離、純化江蘇省南京市高淳地區(qū)雙孢蘑菇疣孢霉菌病菇，對(duì)病菌形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，同時(shí)對(duì)該菌株進(jìn)行藥劑毒力測(cè)定。結(jié)果顯示，試驗(yàn)的5種殺菌劑對(duì)疣孢霉菌生長(zhǎng)均有明顯抑制作用，其中50%咪鮮胺錳絡(luò)合物可濕性粉劑5 g/L的防治效果最顯著。

關(guān)鍵詞：雙孢蘑菇；疣孢霉菌；藥劑；毒力測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào)： S436.46+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）06-0110-03

收稿日期：2013-09-04

基金項(xiàng)目：江蘇省“青藍(lán)工程”資助項(xiàng)目；江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研項(xiàng)目（編號(hào)：2011KJ14）。

作者簡(jiǎn)介：謝春芹（1976—），女，江蘇沭陽(yáng)人，碩士，講師，主要從事食藥用菌教學(xué)與研究。E-mail：xiechunqin@163.com。雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）別稱(chēng)白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇，是世界性栽培和消費(fèi)的菇類(lèi)，我國(guó)栽培最多的省份有福建、山東、河南、浙江等[1]；栽培方式有菇房栽培、大棚架式栽培和大棚畦栽等。疣孢霉菌是一種作用于蘑菇、草菇、鳳尾菇等糞草腐生食用菌的土壤病原真菌，疣孢霉菌別稱(chēng)蘑菇無(wú)頭菇病、褐腐病、蘑菇濕泡病，其平均發(fā)病率約30%，損失率達(dá)30%～40%，高的達(dá)90%。目前我國(guó)各地應(yīng)用苯并咪唑類(lèi)殺菌劑和咪鮮胺錳絡(luò)合物進(jìn)行覆土處理，但效果不一[2]，主要是因?yàn)楦鞯仞噫呙沟牟煌陮?duì)同一種藥劑的敏感性存在一定的差異。南京市高淳區(qū)固城鎮(zhèn)是江蘇省雙孢蘑菇種植最集中、面積最大、總產(chǎn)量最高的基地，近來(lái)遭到疣孢霉的嚴(yán)重危害。本試驗(yàn)采集發(fā)病菇床的雙孢蘑菇，并對(duì)病菇有害疣孢霉進(jìn)行分離鑒定及殺菌劑敏感性試驗(yàn)，篩選出疣孢霉有害菌株的敏感性藥劑，為制定雙孢蘑菇疣孢霉綜合防治措施提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試藥劑種類(lèi)及來(lái)源本試驗(yàn)選用生產(chǎn)上常用的殺菌劑，其種類(lèi)與來(lái)源、試驗(yàn)中所使用的劑量。

1.1.2供試分離疣孢霉菌的病菇本試驗(yàn)采集南京高淳固城鎮(zhèn)九龍村雙孢蘑菇種植基地的病菇，該基地雙孢蘑菇是自然季節(jié)棚式栽培，種植的品種為全國(guó)生產(chǎn)上大面積栽培的A2796，采集時(shí)間為2012年4月，根據(jù)病菇子實(shí)體的形態(tài)變化，采集以下幾大類(lèi)病菇并進(jìn)行編號(hào)。表1供試藥劑及其劑量設(shè)置

藥劑生產(chǎn)廠家劑量設(shè)置（mg/L）70%甲基硫菌靈可濕性粉劑浙江威爾達(dá)化工有限公司120.0、60.0、30.0、15.0、7.570%代森錳鋅可濕性粉劑河北雙吉化工有限公司80、40、20、10、550%多菌靈可濕性粉劑江陰市農(nóng)藥二廠有限公司280.0、140.0、70.0、35.0、17.550%咪鮮胺錳絡(luò)合物可濕性粉劑拜耳作物科學(xué)公司50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78400 g/L氟硅唑乳油美國(guó)杜邦公司8.0、4.0、2.0、1.0、0.5

表2疣孢霉菌分離的病菇子實(shí)體形態(tài)特征

樣品編號(hào)樣品外部形態(tài)樣品內(nèi)部形態(tài)BY1子實(shí)體畸形，有霉層，為正常菇的5倍肉質(zhì)松，菌柄菌蓋空心，變色呈半邊灰半邊黑BY2子實(shí)體畸形，有霉層，無(wú)菌柄和菌蓋，變色微紅肉質(zhì)松如棉花瓤，變色淺咖啡色BY3子實(shí)體畸形，有霉層，無(wú)菌柄和菌蓋，變色灰色肉質(zhì)松，變色淺咖啡色，稍淺于BY2BY4子實(shí)體正常，有霉層，有菌柄和菌蓋，子實(shí)體小肉質(zhì)松，變色茶褐色BY5子實(shí)體畸形，有霉層，無(wú)菌柄和菌蓋，子實(shí)體小，桃狀肉質(zhì)松，中間有裂痕，變色茶褐色BY6子實(shí)體畸形，有霉層，無(wú)菌柄和菌蓋，棗子狀 靠近頂部空心，變色有黑色棱紋BY7子實(shí)體畸形，有霉層，頂部有裂痕，變色深紅至發(fā)暗中間有裂痕，表面針尖大小黃色水滴，變色呈灰暗色BY8子實(shí)體畸形，有霉層，有菌柄無(wú)菌蓋，表面針尖大小黃色水滴 有裂痕，有空洞，變色菌柄和菌蓋交接處褐色BY9子實(shí)體畸形，有菌柄和菌蓋，變色偏灰肉質(zhì)緊密，變色菌柄和菌蓋交接處有黑條紋

1.1.3病菌分離所用的培養(yǎng)基疣孢霉菌的分離采用的是PDA培養(yǎng)基，配方為馬鈴薯200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 20 g、水 1 000 mL，pH值自然，按常規(guī)方法配制，分裝試管，制作平板培養(yǎng)基[2-5]。

1.2方法

1.2.1病菇中疣孢霉菌的分離與培養(yǎng)一是用消毒好的接種鉤摘取病菇表面淡紅色霉層；二是用75%乙醇擦拭組織表面，用無(wú)菌解剖刀將畸形菇體切開(kāi)，然后用無(wú)菌鑷子取病菇內(nèi)部的少量組織，在無(wú)菌條件下接種于PDA平板培養(yǎng)基上，25 ℃ 恒溫培養(yǎng)[6]。在PDA培養(yǎng)基上菌落初期白色，隨菌齡的增加逐漸變?yōu)榘咨q狀，再轉(zhuǎn)為黃色、黃褐色、褐色、暗褐色。

1.2.2疣孢霉的純化培養(yǎng)在無(wú)菌條件下挑取分離病菇疣孢霉尖端菌絲接種于試管培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.2.3疣孢霉的形態(tài)特征鑒定將分離的疣孢霉各個(gè)樣品制成臨時(shí)玻片，在顯微鏡下觀察[3]，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，疣孢霉的分生孢子有2種：第1種是瓜子仁形或松子仁形，無(wú)色，邊緣光滑。第2種是雙孢結(jié)構(gòu)，葫蘆形，大孢褐色、表面網(wǎng)狀；小孢無(wú)色、光滑，菌絲有柄、無(wú)色、管狀。雙孢結(jié)構(gòu)的分生孢子前期無(wú)色，透明，表面光滑，后頂端逐漸膨大，顏色加深，最后下端小孢消失，大孢脫落，深褐色，表面加厚，有不規(guī)則突起（龜紋）。

1.3毒力測(cè)定與統(tǒng)計(jì)方法

1.3.1殺菌劑對(duì)疣孢霉的毒力測(cè)定將生產(chǎn)上常用的5種殺菌劑稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛鹊谷隤DA 培養(yǎng)基中制成PDA平板，并設(shè)空白對(duì)照，將霉菌病原分別接入到制好的5種殺菌劑的平板和空白對(duì)照平板中，放在相同條件下培養(yǎng)，定期測(cè)定不同殺菌劑下霉菌的生長(zhǎng)速度，比較5種殺菌劑分別對(duì)霉菌的抑制效果[4-9]。

1.3.1.1殺菌劑平板培養(yǎng)基制作采用PDA 培養(yǎng)基平板抑菌試驗(yàn)[2]。為避免因高溫而破壞殺菌劑的藥效，待PDA 培養(yǎng)基溫度降至50～60 ℃時(shí)，將5種殺菌劑稀釋成適當(dāng)濃度，在無(wú)菌條件下加入到PDA 培養(yǎng)基的三角瓶中，充分混勻，倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，取15 mL帶藥培養(yǎng)基倒入直徑90 mm的培養(yǎng)皿中，冷卻成藥液平板培養(yǎng)基。

1.3.1.2接種在無(wú)菌條件下，采用打孔接種法（霉菌接種塊直徑為0.5 cm），每種霉菌接5個(gè)平板培養(yǎng)基，并設(shè)有空白對(duì)照。

1.3.1.3培養(yǎng)與測(cè)定放置在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，隔2 d測(cè)量菌絲生長(zhǎng)情況，記錄疣孢霉菌菌落生長(zhǎng)面積，用自動(dòng)式游標(biāo)卡尺測(cè)量不同殺菌劑平板中疣孢霉菌菌絲的生長(zhǎng)面積，即以疣孢霉菌落的長(zhǎng)（cm）和寬（cm）來(lái)計(jì)算[5-6]。

1.3.2殺菌劑對(duì)雙孢蘑菇菌絲的毒力測(cè)定在進(jìn)行疣孢霉菌有效藥劑與最適防治劑量試驗(yàn)的同時(shí)，選取試驗(yàn)中5種殺菌劑對(duì)疣孢霉菌菌絲抑制效果最佳劑量，測(cè)定其對(duì)雙孢蘑菇菌絲毒力，方法與殺菌劑對(duì)菌蓋疣孢霉的毒力測(cè)定方法相同。

2結(jié)果與分析

2.1殺菌劑對(duì)疣孢霉的毒力測(cè)定

供試的5種殺菌劑對(duì)菌蓋疣孢霉菌絲生長(zhǎng)均有抑制作用，且不同藥劑和同一種藥劑的不同劑量對(duì)疣孢霉菌的抑制效果均有明顯差異。由表3可見(jiàn)，70%代森錳鋅 5～80 mg/L對(duì)疣孢霉菌生長(zhǎng)有抑制作用，且隨著劑量的增加，抑制作用增強(qiáng)，尤其是剛接種后2 d，80 mg/L劑量的抑制作用最強(qiáng)，疣孢霉菌菌絲幾乎不生長(zhǎng)。

不同劑量代森錳鋅對(duì)疣孢霉菌生長(zhǎng)的影響

接種時(shí)間

（d）不同劑量下的菌落面積（mm2）CK5 mg/L10 mg/L20 mg/L40 mg/L80 mg/L2221.8120.3193.0933.133.133.141 291.0824.57710.7433.133.133.163 380.62 353.92 274.21 483.3545.433.1

70%甲基硫菌靈7.5～120 mg/L對(duì)疣孢霉菌生長(zhǎng)有抑制作用，且隨著劑量的增加，抑制作用增強(qiáng)。其中，7.5 mg/L劑量的抑制作用最弱，接種后2 d抑制效果不明顯；而30 mg/L的劑量對(duì)疣孢霉菌抑制效果非常明顯，菌絲從剛接種至培養(yǎng)后6 d幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)。表4不同劑量甲基硫菌靈對(duì)疣孢霉菌生長(zhǎng)的影響

接種時(shí)間

（d）不同劑量下的菌落面積（mm2）CK7.5 mg/L15.0 mg/L30.0 mg/L60.0 mg/L120.0 mg/L2221.8211.598.233.133.133.141 291.01 228.6307.433.133.133.163 380.62 909.033.133.133.133.1

50%咪鮮胺錳絡(luò)合物0.63～10.00 mg/L對(duì)疣孢霉菌生長(zhǎng)均有抑制作用，尤其是剛接種后2 d菌絲生長(zhǎng)緩慢，幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)，之后菌絲在低劑量下的生長(zhǎng)快于高劑量。劑量5 mg/L以上對(duì)疣孢霉菌抑制效果最明顯，菌絲從剛接種至培養(yǎng)后6 d幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)。

50%多菌靈17.5～280.0 mg/L對(duì)疣孢霉菌生長(zhǎng)均有抑制作用，隨著劑量的增加，抑制作用增強(qiáng)。

氟硅唑17.5～280 mg/L對(duì)疣孢霉菌生長(zhǎng)均表5不同劑量咪鮮胺錳絡(luò)合物對(duì)疣孢霉菌生長(zhǎng)的影響

接種時(shí)間

（d）不同劑量下的菌落面積（mm2）CK0.63 mg/L1.30 mg/L2.50 mg/L5.00 mg/L10.00 mg/L2221.833.133.1 33.133.133.141 291.0206.2175.0125.933.133.163 380.6384.7321.0268.033.133.1

不同劑量多菌靈對(duì)疣孢霉菌生長(zhǎng)的影響

接種時(shí)間

（d）不同劑量下的菌落面積（mm2）CK17.5 mg/L35.0 mg/L70.0 mg/L140.0 mg/L280.0 mg/L2221.2170.6160.1102.699.998.941 291.91 136.71 234.7840.7694.8584.263 380.43 184.91 946.31 578.71 300.61 294.0

不同劑量氟硅唑?qū)︷噫呙咕L(zhǎng)的影響

接種時(shí)間

（d）不同劑量下的菌落面積（mm2）CK17.5 mg/L35.0 mg/L70.0 mg/L140.0 mg/L280.0 mg/L2256.7107.489.7———41 578.9745.2574.5———63 367.51 277.31 184.3———

有抑制作用，隨著劑量的增加，抑制作用增強(qiáng)。當(dāng)氟硅唑劑量在70 mg/L及以上時(shí)，疣孢霉菌菌絲不能生長(zhǎng)。

2.2殺菌劑對(duì)雙孢蘑菇菌絲的毒力測(cè)定

試驗(yàn)選取5種藥劑最適防治劑量（代森錳鋅80 mg/L、甲基硫菌靈30 mg/L、咪鮮胺錳絡(luò)合物5 mg/L、多菌靈280 mg/L和氟硅唑70 mg/L）進(jìn)行雙孢蘑菇菌絲的毒力測(cè)定，測(cè)定對(duì)雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可見(jiàn)，各殺菌劑對(duì)雙孢蘑菇菌絲均有一定抑制作用，其中抑制作用最強(qiáng)的是氟硅唑，最弱的是咪鮮胺錳絡(luò)合物。

不同殺菌劑對(duì)雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)的影響

藥劑菌絲生長(zhǎng)速率（mm/d）CK5.17代森錳鋅5.09甲基硫菌靈5.13氟硅唑5.01多菌靈5.14咪鮮胺錳絡(luò)合物5.15

3小結(jié)

3.1疣孢霉菌病菌形態(tài)特征

本試驗(yàn)分離得到的疣孢霉形態(tài)特征及培養(yǎng)特征與文獻(xiàn)[3]中的一致。疣孢霉菌廣泛分布在土壤中，病源體置于土表2～39 cm處。病殘?bào)w內(nèi)的休眠孢子囊能在露地或室內(nèi)抵抗嚴(yán)寒，順利越冬。露地越冬位置以在土內(nèi)3～20 cm致病力最強(qiáng)，過(guò)深過(guò)淺致病力均顯著下降[8]。蘑菇受感染出現(xiàn)病癥，需11 d以上的時(shí)間。

菇房中疣孢霉菌主要來(lái)自覆土，其次是由人、鳥(niǎo)或昆蟲(chóng)傳播。當(dāng)孢子落在生育中的蘑菇附近時(shí)才會(huì)感染。菌蓋和菌柄基部長(zhǎng)出白色絨毛狀菌絲，進(jìn)而轉(zhuǎn)變成暗褐色，并流出褐色汁液而腐爛，散發(fā)出惡臭?？諝獬睗駮r(shí)，會(huì)使菌蓋和菌柄出現(xiàn)褐色病斑，所以又稱(chēng)為褐腐病。

3.2殺菌劑對(duì)疣孢霉的抑制作用和對(duì)雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)的影響

采用的5種藥劑都是市場(chǎng)上常見(jiàn)的殺菌劑，能顯著影響有害疣孢霉菌絲生長(zhǎng)，涂改臨等認(rèn)為，多菌靈具有廣譜性，是多位點(diǎn)殺菌劑，殺菌能力強(qiáng)，對(duì)蘑菇低毒、安全、低殘留且不易產(chǎn)生抗藥性[7，9]。但是本試驗(yàn)結(jié)果顯示多菌靈效果較差，不能較好地抑制疣孢霉菌絲的生長(zhǎng)，這可能是由于近年來(lái)多菌靈的使用較普遍，疣孢霉菌對(duì)其產(chǎn)生了抗藥性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，50%咪鮮胺錳絡(luò)合物可濕性粉劑對(duì)疣孢霉菌絲抑制效果顯著，且對(duì)雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)影響較小，建議生產(chǎn)上可以使用50%咪鮮胺錳絡(luò)合物可濕性粉劑作為疣孢霉防治藥劑。

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