進(jìn)境旅客攜帶的澳大利亞蘋果中美澳型核果褐腐病菌的檢測與鑒定

許萍萍 李彬 吳翠萍 漆少廷 羅朝科 羅建國 安榆林

摘要：南京祿口國際機(jī)場口岸從進(jìn)境旅客攜帶的澳大利亞蘋果中截獲疑似褐腐病果。病果表面靠近果肩處有水漬狀褐色病斑，經(jīng)保濕培養(yǎng)后褐色病斑迅速擴(kuò)展至全果，果實(shí)表面出現(xiàn)灰褐色絨狀霉層，果實(shí)腐爛。對病果進(jìn)行分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、PCR檢測及ITS序列分析和致病性測定后，將病菌鑒定為美澳型核果褐腐病菌（Monilinia fructicola）。這是江蘇省首次從旅客攜帶的澳大利亞蘋果中截獲該檢疫性有害生物。

關(guān)鍵詞：蘋果病害；真菌鑒定；旅檢；美澳型核果褐腐病菌

中圖分類號： S41-3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0119-03

收稿日期：2013-09-06

作者簡介：許萍萍（1982—），女，江蘇鹽城人，碩士，農(nóng)藝師，主要從事植物檢疫工作。E-mail：xupp@jsciq.gov.cn。褐腐病是桃、李、杏、蘋果等果樹上的一種危害嚴(yán)重的水果病害，引起該病害的病原菌之一的美澳型核果褐腐病菌（Monilinia fructicola）是我國進(jìn)境植物檢疫性有害生物，該病原菌的主要寄主為薔薇科果樹，尤其以核果類李屬（Prunus）的李、杏、桃、油桃、櫻桃、蘋果、梨和葡萄等果樹受害最嚴(yán)重，曾對北美和澳大利亞的核果造成巨大損失。美澳型褐腐病菌既能在果園中引起危害，又能危害儲藏期果實(shí)，并可在果實(shí)中潛伏侵染，隨病果遠(yuǎn)距離傳播，美澳型核果褐腐病菌目前在日本、印度、韓國、美國、加拿大、澳大利亞、新西蘭、法國等多個(gè)國家均有分布，我國北京和臺灣地區(qū)也有局部發(fā)生危害的報(bào)道[1]。該病菌可隨帶病的苗木及水果通過貿(mào)易和旅客攜帶進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。2013年6月，南京祿口國際機(jī)場口岸從進(jìn)境旅客攜帶的澳大利亞蘋果中截獲一批可疑病果。為防止美澳型核果褐腐病菌傳入我國，筆者對病果及其分離物進(jìn)行了分離培養(yǎng)、病原菌形態(tài)學(xué)觀察、PCR分子檢測，并遵循柯赫氏法則進(jìn)行致病性測定，對這批病蘋果攜帶的病菌進(jìn)行了檢測和鑒定。

1材料與方法

1.1材料與試劑

材料為南京祿口國際機(jī)場從進(jìn)境旅客攜帶的澳大利亞蘋果中截獲的可疑病果。培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。

1.2癥狀檢查及保濕培養(yǎng)

對可疑病果的癥狀進(jìn)行觀察，取有褐色病斑的果實(shí)直接進(jìn)行分離培養(yǎng)。病果初期有褐色病斑，溫度適宜時(shí)，褐色病斑迅速擴(kuò)大至全果，果肉隨之變軟腐爛。潮濕條件下，病果表面凹陷處有灰色霉層，其上產(chǎn)生分生孢子梗束。有些潛伏侵染的果實(shí)表面暫時(shí)無明顯癥狀，對這類果實(shí)可進(jìn)行保濕培養(yǎng)，將果實(shí)放在密閉的塑料盒中，20～25 ℃下保濕培養(yǎng)，7 d 后開始每天檢查，直至出現(xiàn)褐腐病斑癥狀，再對果實(shí)進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.3組織分離與培養(yǎng)

取有褐色病斑的果實(shí)進(jìn)行分離培養(yǎng)，用70%乙醇對果實(shí)表面進(jìn)行消毒，等乙醇揮發(fā)后，從病健交界處切取或用鑷子撕取邊長為5～10 mm 的樣品，放在PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)，待菌落出現(xiàn)鏡檢。

1.4形態(tài)學(xué)觀察與生物學(xué)鑒定

如果菌落上的分離物形態(tài)特征與美澳型核果褐腐病菌相似，則對疑似菌株進(jìn)行純化，并對菌落的顏色、生長速度、產(chǎn)孢量和孢子堆的形狀等菌落形態(tài)學(xué)特征和生物學(xué)性狀進(jìn)行觀察和測定。先將轉(zhuǎn)到PDA 上的美澳型核果褐腐病菌疑似菌株放在22 ℃下暗培養(yǎng)4 d，用4 mm的打孔器在菌落邊緣打孔取樣，將菌落轉(zhuǎn)移至直徑為9 cm的PDA 培養(yǎng)皿中央，22 ℃下12 h光照/12 h暗培養(yǎng)，光照波長為320～380 nm、18 W黑光燈（近紫外燈）2盞，置于培養(yǎng)皿上方約15 cm處，培養(yǎng)3 d后開始每天測量菌落直徑，直到第5天開始計(jì)算并記錄菌落的生長速度、顏色、產(chǎn)孢量、孢子堆形狀。

1.5分子生物學(xué)鑒定

1.5.1DNA提取采用Tooley等的堿裂解法[2]直接從培養(yǎng)基中快速提取菌絲DNA。疑似菌株經(jīng)純化后在PDA上生長 2 d，取菌絲塊放入2 mL的離心管中，加入50 μL的0.5 mol/L NaOH和2粒以上直徑為3 mm的鋼珠，在球磨儀（Retsch MM400，德國）上以30 f/s的頻率振蕩180 s，12 000 r/min離心5 min，取10 μL上清液直接溶于90 μL 100 mmol/L Tris溶液（pH值8.0）中。也可以采用CTAB 方法或真菌基因組提取試劑盒（如DNeasy Plant Mini Kit，QIAGEN，德國）提取病菌DNA。DNA提取后直接進(jìn)行PCR檢測或-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2PCR引物根據(jù)文獻(xiàn)[1]中推薦的方法，對分離到的疑似菌株采用PCR檢測方法進(jìn)行鑒定。美澳型核果褐腐病菌的特異性引物ITS1-Mfcl 和ITS4-Mfcl 序列為5′-TATGCTCGCCAGAGGATAATT-3′和5′-TGGGTTTTGGCAGA-AGCACACT- 3′，預(yù)期擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物大小為 356 bp，PCR 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司代為合成。

1.5.3PCR擴(kuò)增50 μL PCR 反應(yīng)體系中含有1×PCR緩沖液（無Mg2+）、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTP、各引物0.2 μmol/L、1.25 U Taq DNA聚合酶、2 μL DNA溶液，補(bǔ)ddH2O至反應(yīng)總體積為50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，67.5 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.5.4PCR產(chǎn)物的檢測PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測， 用凝膠成像儀觀察、拍照、記錄檢測結(jié)果。

1.5.5PCR產(chǎn)物核苷酸序列分析PCR 產(chǎn)物純化后委托南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行核苷酸序列測定。采用BioEdit和DNAStar軟件對測序結(jié)果與GenBank發(fā)表的美澳型核果褐腐病菌ITS核苷酸序列進(jìn)行比較和同源性分析。

1.6致病性測定

采用菌絲塊接種法，用4 mm的打孔器在菌落邊緣打孔取樣，作為接種菌絲塊。選用新鮮健康的蘋果果實(shí)，先用70%乙醇對要接種的果實(shí)表面進(jìn)行消毒，再用解剖刀切開接種部位切取少量果肉，將菌絲塊接入果肉中，將接種的蘋果放入密閉塑料盒中，22 ℃下保濕培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置空白對照。

2結(jié)果與分析

2.1病果癥狀

截獲的病果初期有褐色病斑，經(jīng)保濕培養(yǎng)后4 d，褐色病斑迅速擴(kuò)大至全果，果實(shí)表面凹陷處密布灰褐色絨狀霉層（圖1），其上產(chǎn)生大量分生孢子梗束，果肉隨之變軟腐爛。

2.2病菌生物學(xué)特性

2.2.1菌落特征取病果病健交界處果皮進(jìn)行組織分離，對疑似美澳型核果褐腐病菌菌落進(jìn)行純化，取直徑4 mm菌絲塊在PDA 上22 ℃光暗交替培養(yǎng)，菌落生長速度很快，7 d后菌落布滿直徑 9 cm 培養(yǎng)皿。菌落榛子色或灰褐色，邊緣較整齊，產(chǎn)孢量豐富，菌落表面形成明顯的同心輪紋狀分生孢子堆（圖2）。菌株的培養(yǎng)特性與van Leeuwen等描述的美澳型核

果褐腐病菌的菌落特征[3-4]一致。

2.2.2病菌形態(tài)經(jīng)顯微鏡觀察，疑似菌株菌絲無色，有分枝，分生孢子梗較短，頂端串生分生孢子，芽生，鏈狀排列，檸檬形或卵圓形，近無色，單胞（圖3）。分生孢子為 10.28～19.65 μm × 6.62 ～ 14.60 μm，平均值為14.70 μm × 9.79 μm。分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生后產(chǎn)生的芽管較長。病菌的形態(tài)學(xué)特征與已報(bào)道的美澳型核果褐腐病菌的形態(tài)特征[1，3，5]完全相符。

2.3病菌PCR分子檢測及序列分析

2.3.1病菌PCR檢測采用美澳型核果褐腐病菌特異性引物ITS1-Mfc1和ITS4-Mfc1對疑似菌株進(jìn)行PCR分子檢測。結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增出1條大小為356 bp的特異性目的條帶，與陽性對照大小一致（圖4）。將PCR產(chǎn)物送往南京金斯瑞生物科技有限公司純化測序。

2.3.2病菌PCR 產(chǎn)物序列測定與同源性分析PCR 產(chǎn)物經(jīng)測序和BLAST 分析，結(jié)果表明，PCR 產(chǎn)物核苷酸序列與 GenBank 中40多個(gè)美澳型核果褐腐病菌已知的ITS基因序列（GenBank登錄號：JN176556、HQ846919、GU967379、GQ979713、FJ515894、AM887528、DQ314727等）同源性均為100%。序列比對的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了PCR 產(chǎn)物是美澳型核果褐腐病菌的特異性產(chǎn)物。

2.4致病性測定

采用菌絲塊對新鮮健康的蘋果果實(shí)進(jìn)行接種，經(jīng)保濕培養(yǎng)， 蘋果果實(shí)3～4 d出現(xiàn)褐色病斑，病斑擴(kuò)展迅速， 8 d后整

個(gè)果實(shí)表面全部變?yōu)楹稚?2 d后果實(shí)表面被散生的灰裼色絨狀霉層覆蓋（圖5），其上產(chǎn)生大量分生孢子堆，果實(shí)腐爛?？瞻讓φ諢o褐腐癥狀出現(xiàn)，也無絨狀霉層產(chǎn)生。從接種發(fā)病的蘋果果實(shí)上可重新分離到疑似美澳型核果褐腐病菌菌株，病菌的生物學(xué)特性與接種病菌完全相同。

3結(jié)論與討論

美澳型核果褐腐病菌有3個(gè)近似種，即核果鏈核盤菌（M.laxa）、果生鏈核盤菌（M. fructigena）和 M.polystroma。這4個(gè)種可通過菌落特征、分生孢子大小、分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生的芽管、產(chǎn)孢量和PCR特異性擴(kuò)增來加以區(qū)分[1，3-6]，通過ITS序列及微衛(wèi)星序列差異建立的常規(guī)PCR方法[1，5-7]、SYBR實(shí)

時(shí)PCR方法[8]和Taq Man-MGB探針[9]等PCR檢測方法可以快速、準(zhǔn)確地在種的水平上將這4個(gè)近似種區(qū)分開來。

美澳型核果褐腐病菌是我國進(jìn)境植物檢疫性有害生物，該病原菌主要危害核果類李屬果樹，會給果園造成巨大損失。除了蘋果以外，我國口岸多次從旅客攜帶的李、櫻桃、西梅及進(jìn)境貿(mào)易水果（葡萄、李和櫻桃）貨物中截獲過該病菌[5，10-12]。該病菌既能在果園中引起危害，又能危害儲藏期果實(shí)，并可在果實(shí)中潛伏侵染，隨病果遠(yuǎn)距離傳播。進(jìn)境旅客攜帶的水果雖然數(shù)量少，但是水果種類多，來源廣，產(chǎn)地復(fù)雜，美澳型核果褐腐病菌隨水果傳入的疫情風(fēng)險(xiǎn)很高，所以我國各口岸應(yīng)加強(qiáng)對入境旅客攜帶水果的檢疫，防止通過旅客攜帶的水果將該病菌傳入我國，以保護(hù)我國水果生產(chǎn)和貿(mào)易的安全。

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