張 玲, 王夢(mèng)雨, 黃 薇, 劉國(guó)慶

(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部心血管研究所，北京 100191)

冠心病(coronary heart disease, CHD)是嚴(yán)重危脅人類生命和健康的重要疾病。流行病學(xué)研究顯示男性較女性的冠心病發(fā)病率高，發(fā)生時(shí)間早。女性在絕經(jīng)前發(fā)病率較低,絕經(jīng)后迅速增加,幾乎達(dá)到絕經(jīng)前的4倍[1]。隨著對(duì)冠心病的不斷研究,人們發(fā)現(xiàn)隨著年齡增長(zhǎng)女性患者的數(shù)量逐年增加,尤其女性絕經(jīng)后其患病率及病死率與同年齡的男性患者接近一致[2]。而有實(shí)驗(yàn)研究也表明，在動(dòng)脈硬化、高血壓、腦出血等心腦血管系統(tǒng)疾病等動(dòng)物模型中，雄性較雌性的發(fā)生率更高[3]。但由于雄性動(dòng)物較雌性對(duì)輻射更為敏感，對(duì)照射劑量的耐受比較差[2]，所以一直以來(lái)骨髓移植的方法中大多用雄性作為供體雌性作為受體，以雌性受體外周血中是否檢測(cè)到Y(jié)染色體來(lái)作為骨髓移植是否成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。然而，雌性作為受體不僅要受到性周期的影響，而且內(nèi)源性巨噬細(xì)胞的殘存情況不清楚[5]，無(wú)法顯示自身殘存的巨噬細(xì)胞與外源性轉(zhuǎn)入的巨噬細(xì)胞的比例，從而無(wú)法準(zhǔn)確判斷機(jī)體相應(yīng)指標(biāo)變化是否源于被轉(zhuǎn)入的外源性巨噬細(xì)胞[6]。將雌性小鼠骨髓成功轉(zhuǎn)移到雄性小鼠體內(nèi)可以有效解決上述難題，可以準(zhǔn)確地反映對(duì)巨噬細(xì)胞來(lái)源的生物活性物質(zhì)對(duì)機(jī)體脂代謝的影響，并將其量化。這對(duì)心血管系統(tǒng)疾病在易感和高發(fā)人群中的研究奠定了良好的基礎(chǔ)，提供了新的研究平臺(tái)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

C57BL/6小鼠，6～8周齡的SPF級(jí)雄性及雌性小鼠作為骨髓移植受體。同種系同年齡不同性別的小鼠作為骨髓移植供體，以上動(dòng)物均由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 方法

2.1分組及骨髓移植 (1)實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)照射強(qiáng)度分為900rad 、 950 rad及1 000 rad 3組，每個(gè)照射強(qiáng)度均分為實(shí)驗(yàn)組(放射性照射后進(jìn)行骨髓移植組)和對(duì)照組(僅放射性照射不進(jìn)行骨髓移植)，其中實(shí)驗(yàn)組又分為雄性小鼠轉(zhuǎn)雌性小鼠組及雌性小鼠轉(zhuǎn)雄性小鼠組。(2)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：移植實(shí)驗(yàn)前7 d至移植實(shí)驗(yàn)后7 d，受體小鼠均飲用加有新霉素(100 mg/L)和多黏菌素B(10 mg/L)的滅菌蒸餾水(pH 5.2)[7-8]。斷頸處死供體小鼠，無(wú)菌條件下采集供體小鼠股骨及小腿骨。將股骨兩端軟骨剪去，露出紅色的骨髓腔。用1 mL無(wú)菌注射器吸取含2%小牛血清及肝素的RPMI-1640液，輕輕插入骨髓腔，反復(fù)沖出骨髓腔內(nèi)的骨髓，用ACK緩沖液溶解紅細(xì)胞，用含2%胎牛血清的RPMⅠ-1640洗滌2次,計(jì)數(shù)并用不含血清的RPMI-1640調(diào)整細(xì)胞濃度為3×1010/L備用[9]。將雄性或雌性受體小鼠采用[137Cs]全身照射，[137Cs]放射源(Gama Cell 1000)由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系提供。照射后6 h將同性別小鼠分為2組，骨髓移植實(shí)驗(yàn)組經(jīng)C57BL/6小鼠尾靜脈每只注射1×107供體小鼠骨髓細(xì)胞，對(duì)照組不給予骨髓移植(n=9)。骨髓移植實(shí)驗(yàn)組根據(jù)骨髓移植后14 d 的存活率及體內(nèi) Y 染色體基因水平的下降評(píng)估骨髓移植實(shí)驗(yàn)的成功率，根據(jù)外周血白細(xì)胞數(shù)量變化評(píng)估骨髓移植的骨髓重建情況，根據(jù)受體小鼠雄性Y染色體的殘余量作為移植質(zhì)控指標(biāo)。對(duì)照組14 d 內(nèi)全部死亡說(shuō)明骨髓移植照射成功[10]。

2.2外周血白細(xì)胞數(shù)量測(cè)定 從骨髓移植實(shí)驗(yàn)第7天起，每天眼眶取血10 μL，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組及正常陽(yáng)性對(duì)照組小鼠外周血鏡下白細(xì)胞計(jì)數(shù)[10]。

2.3Y染色體含量檢測(cè) 取小鼠血漿，按照血液DNA提取試劑盒說(shuō)明操作提取血液中的基因組DNA，測(cè)DNA濃度后，-20 ℃保存?zhèn)溆?。利用?shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Y染色體含量，小鼠Y染色體基因序列設(shè)計(jì)，上游引物5′- TCGGAGGGCTAAAGTGTC-3′，下游引物5′-CCAGTCTTGCCTGTATGTGAT-3′。在0.5 mL的EP管中加入雙蒸水、引物、25 mmol/L MgCl2、2 mmol/L dNTP、10×buffer、DNA和Taq酶/SYBR，總體積為20 μL[11-12]。PCR條件：94 ℃ 5 min,94 ℃ 40 min，56 ℃ 45 min，72 ℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)。血液DNA提取試劑盒由安徽優(yōu)晶生物工程有限公司提供，Taq酶和dNTP以及marker購(gòu)自GeneStar，SYBR購(gòu)自Transgene。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0軟件分析，死亡率兩組間比較采用2檢驗(yàn)，其它用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 骨髓移植后受體小鼠存活率

圖1顯示，1 000 rad照射后未進(jìn)行骨髓移植的對(duì)照組14 d內(nèi)全部死亡，表明照射劑量達(dá)到致死量，符合實(shí)驗(yàn)要求。經(jīng)骨髓移植后雄性轉(zhuǎn)雌性組30 d存活率為100%，雌性轉(zhuǎn)雄性組30 d存活率僅為48%，明顯低于雄性轉(zhuǎn)雌性組，說(shuō)明1 000 rad照射劑量?jī)H適用于雄轉(zhuǎn)雌的骨髓移植實(shí)驗(yàn)，并不適用于雌轉(zhuǎn)雄的骨髓移植實(shí)驗(yàn)。

Figure 1. Survival rates of recipient mice treated with 1 000 rad irradiation and bone marrow transplantation (BMT) from male to female mice or from female to male mice. n=9.

圖2顯示，雌性小鼠做供體骨髓移植到雄性小鼠體內(nèi)，在不同劑量照射下存活情況有所不同。950 rad和900 rad照射劑量后生存率都優(yōu)于1 000 rad照射劑量，其中900 rad劑量組骨髓移植后存活率最提高可達(dá)到100%，為最佳雌轉(zhuǎn)雄照射劑量，與圖1顯示的在1 000 rad劑量下雄性骨髓移植給雌性的生存率相當(dāng)。

Figure 2. Survival rates of recipient mice treated with different doses of radiation and bone marrow transplantation (BMT) from female mice to male mice or from female to male mice. n=9.

2 骨髓移植后受體雄性小鼠Y染色體基因水平檢測(cè)

骨髓移植后，隨時(shí)間進(jìn)展，Y染色體基因表達(dá)逐漸減少，說(shuō)明受體雄性小鼠的骨髓逐漸被破壞，根據(jù)不同照射劑量其骨髓細(xì)胞被替代的程度和時(shí)間都不盡相同。在950 rad照射劑量下雌性骨髓移植給雄性小鼠后，雄性小鼠血液中的Y染色體含量逐漸下降，至4周時(shí)完全被替代，見(jiàn)圖3A。900 rad劑量照射下雌性骨髓移植給雄性小鼠后，雄性小鼠血液中的Y染色體含量逐漸下降，至5周時(shí)完全被替代，見(jiàn)圖4A。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示不同劑量照射下骨髓移植后受體小鼠骨髓被替代的具體百分比表明，950 rad劑量照射下受體原有骨髓細(xì)胞2周內(nèi)下降到25%，4周內(nèi)被供體骨髓完全替代，見(jiàn)圖3B。900 rad照射劑量下受體原有骨髓細(xì)胞2周內(nèi)下降到60%，4周時(shí)尚有12.5%的殘留，5周時(shí)可被供體骨髓完全替代，見(jiàn)圖4B。900 rad條件下受體小鼠骨髓被完全替代的時(shí)間比950 rad劑量照射的結(jié)果延遲1周。

Figure 3. Y gene level of mice at different time points detected by PCR (A) and real-time PCR (B) after treatment with 950 rad irradiation and bone marrow transplantation. M: marker; P: positive control; N: negative control. Mean±SD. n=9. **P<0.01 vs positive control.

3 雌性骨髓移植后雄性小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化

與正常對(duì)照組小鼠比,移植后1周，骨髓移植組外周血白細(xì)胞數(shù)明顯下降，僅6.0×107/L，第10天開(kāi)始增加，第13天恢復(fù)到正常水平的80%，2周后穩(wěn)定在正常小鼠水平(5.0×109/L)，表明骨髓移植后2周雄性小鼠骨髓造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)恢復(fù)正常,見(jiàn)圖5。

Figure 4. Y gene level of mice at different time points detected by PCR (A) and real-time PCR (B) after treatment with 900 rad irradiation and bone marrow transplantation. M: marker; P：positive control; N: negative control.Mean±SD.n=9. *P<0.05,**P<0.01 vs positive control.

Figure 5. The peripheral blood leukocyte count at different time points after bone marrow transplantation (BMT) from female to male mice. Mean±SD. n=9.

討 論

按照本文所述實(shí)驗(yàn)條件，在[137Cs]照射劑量為900 rad時(shí)，能成功地將雌性小鼠骨髓轉(zhuǎn)至雄性小鼠體內(nèi)，受體骨髓能完全被外源性骨髓代替，同時(shí)受體存活率為100%[13]。因此，900 rad劑量照射后，既可以保證受體小鼠的生存率又可以在一定時(shí)間內(nèi)有效地將原有內(nèi)源性基因完全替代達(dá)到實(shí)驗(yàn)效果，可以作為雌轉(zhuǎn)雄骨髓移植的最佳條件。不同劑量照射下經(jīng)骨髓移植的小鼠體內(nèi)內(nèi)源性基因在2～3周時(shí)明顯被外源性基因所代替，4～5周時(shí)被完全替代并發(fā)揮造血功能。因此用950 rad劑量照射后進(jìn)行的骨髓移植實(shí)驗(yàn)其相關(guān)功能指標(biāo)的測(cè)定應(yīng)在第5周開(kāi)始，而用900 rad劑量照射后則在骨髓移植后第4周尚有較多的殘留，相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定需要推遲到第6～8周再進(jìn)行檢測(cè)[14-15]。這就為我們進(jìn)行不同周期的實(shí)驗(yàn)提供了可靠的數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示骨髓移植后需要高脂飲食8周采集數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)適用于900 rad照射劑量，而需要采集骨髓移植后4周數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)則適用于950 rad照射劑量，不能用存活率高的900 rad照射劑量，否則會(huì)由于原受體骨髓細(xì)胞的殘留而影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和對(duì)結(jié)果的分析[16-17]。

骨髓移植后，小鼠迅速恢復(fù)了造血功能，10 d后外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)開(kāi)始逐步增加，13 d后外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)基本恢復(fù)正常。相應(yīng)免疫指標(biāo)的測(cè)定可根據(jù)此數(shù)據(jù)在合適的時(shí)點(diǎn)進(jìn)行。

綜上所述，本研究創(chuàng)建了小鼠雌轉(zhuǎn)雄骨髓移植的實(shí)驗(yàn)方法，可在不受雌性激素水平的影響下研究從巨噬細(xì)胞來(lái)源的目的基因在心血管疾病中的作用，并為此類研究提供了一個(gè)很好的動(dòng)物模型。為研究巨噬細(xì)胞特異性基因?qū)π难芗膊〉挠绊懙於藢?shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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