翟亞南，王晶晶，李 夢(mèng)，池亞菲，孟 霞，彭博雅，焦 昆，盧 靜

(首都醫(yī)科大學(xué),北京 100069)

肝臟疾病是人類最常見的疾病之一, 嚴(yán)重威脅著人類健康。為此,研發(fā)抗肝臟疾病的有效藥物顯得尤為重要。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是藥物進(jìn)入臨床的必經(jīng)之路,在研發(fā)抗肝臟疾病藥物過程中,選擇有科學(xué)性、實(shí)用性、重現(xiàn)性的肝損傷動(dòng)物模型的意義十分重要[1]。目前，有很多藥物誘導(dǎo)肝損傷模型，但是重復(fù)性和模擬性好的藥物毒性大，或建模結(jié)果不夠穩(wěn)定。D-氨基半乳糖毒性小，使用方便，但用于誘導(dǎo)大鼠肝損傷模型，有研究認(rèn)為用于小鼠模型不穩(wěn)定[2]。為此,本實(shí)驗(yàn)就以D-氨基半乳糖聯(lián)合脂多糖(以下簡(jiǎn)稱D+L)致小鼠慢性肝損傷模型的制備進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性BALB/ c小鼠22只，體重18～22 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)有限公司【SCXK(京)2012-0001】。在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部屏障環(huán)境開展實(shí)驗(yàn)【SYXK(京)2010-0020】。室溫20℃～25℃, 相對(duì)濕度40%～70%。小鼠分籠飼養(yǎng), 每籠飼養(yǎng)3～4只，給予自由進(jìn)食和飲水，飼料和飲水均經(jīng)滅菌處理。

1.2 試劑與儀器

D-氨基半乳糖(Nanjing Boyuan Pharmatech Co.,Ltd，20100521)、脂多糖(美國(guó)Sigma公司，L2880，10 mg)、Masson染色試劑盒(南京建成科技有限公司，20100318)D+L注射液：1800 mgD-氨基半乳糖加入54 mL生理鹽水后，加入6 mL濃度為20 μg/mL脂多糖，配置成30 mg/mL lD-氨基半乳糖和2 μg/mL脂多糖的混合溶液、4%甲醛固定液：10 mL40%甲醛溶液加入90 mL蒸餾水10倍稀釋。石蠟包埋機(jī)(LeicaEG1160)、旋轉(zhuǎn)切片機(jī)(LEICA，RW2235)、烘片機(jī)(LEICAHI1220)、自動(dòng)染色儀(LEICA，AUTOSTAINERXL)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司，WG-7)、光學(xué)顯微鏡(Nikon)、Nikon數(shù)字顯微照相機(jī)(日本Nikon公司，Eccipse8oi)、圖像采集分析系統(tǒng)(NIS-ElementsBasicResearch)、水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司，HH-W600)、脫水機(jī)(Leica，ASP300S)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備和實(shí)驗(yàn)組分組：22只BALB/ c小鼠隨機(jī)分成三組，空白對(duì)照組6只，LPS對(duì)照組8只，D+L組8 只，D+L組30 mg/mL gD-氨基半乳糖為+2 μg/mL脂多糖(LPS)混合液，空白對(duì)照組組同體重?zé)o菌生理鹽水，LPS對(duì)照組2 μg/mL脂多糖(LPS)溶液，1次/2天，連續(xù)注射8周，給予途徑均為腹腔。

1.3.2 取材: 10%水合氯醛麻醉后，用眼球動(dòng)靜脈采血法取血1 mL，離心3000 r/min 10 min，取上清- 80℃凍存待測(cè)。用脫頸椎方法使小鼠安樂死，解剖取肝臟，觀察肝臟變化；取肝左葉于4%甲醛溶液固定,石蠟包埋,制備組織切片, 其余肝組織放置-80℃冰箱保存。

1.3.3 肝功能指標(biāo)測(cè)定:采用日立7180全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠血清ALT、AST水平。

1.3.4 病理學(xué)及細(xì)胞凋亡變化:以石蠟包埋的肝組織標(biāo)本制備4 μm切片, HE染色,鏡下觀察病理組織變化,包括肝細(xì)胞的變性壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維間隔及假小葉的形成等病理變化。

1.3.5 肝組織切片水化脫蠟，使用Masson染色試劑盒染色，藍(lán)紫色表達(dá)為膠原纖維。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

空白對(duì)照組小鼠毛發(fā)有光澤，活動(dòng)正常，精神狀態(tài)良好，飲食量正常；LPS對(duì)照組小鼠毛發(fā)有光澤，活動(dòng)較多，精神狀態(tài)良好，飲食量正常；實(shí)驗(yàn)組小鼠毛發(fā)逐步凌亂無光澤,精神萎靡,活動(dòng)漸少，飲食量少,對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍。

2.2 肝功能指標(biāo)

如表1示，第8周D+L慢性肝損傷BALB/c小鼠血清ALT水平與空白對(duì)照組、LPS對(duì)照組比較，D+L組極顯著性增加(P< 0.01)；D+L組AST水平與空白對(duì)照組、LPS對(duì)照組比較，無明顯變化(P> 0.05)；AST/ALT比值，與空白對(duì)照組比較，D+L組顯著性降低(P< 0.05)，LPS組顯著性增加(P< 0.05)，與LPS對(duì)照組比較，D+L組極顯著性降低(P< 0.01)。

表1 第8周D+L肝損傷BALB/c小鼠血清ALT、AST水平組間比較

2.3 小鼠D+L慢性肝損傷過程中肝臟大體形態(tài)學(xué)、病理學(xué)變化

實(shí)驗(yàn)第8周時(shí)，空白對(duì)照組肝臟呈鮮紅色,表面光滑、邊緣整齊,病理切片顯示肝細(xì)胞、匯管區(qū)、膽管上皮細(xì)胞等形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,未見變性、壞死等；LPS對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，小葉結(jié)構(gòu)，細(xì)胞形態(tài)排列等，未見明顯差異；D+L組肝臟體積縮小，邊緣變薄， HE染色可見(封底圖1)，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，網(wǎng)狀纖維等支架組織發(fā)生明顯變化。10倍鏡下D+L組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，有結(jié)節(jié)性增生，40倍鏡下可見結(jié)節(jié)性增生區(qū)域，肝上皮細(xì)胞細(xì)胞核初相濃縮、溶解、壞死等現(xiàn)象，壞死灶密集分布，枯否氏細(xì)胞顯著增多。Masson染色(封底圖2)，空白對(duì)照組肝組織10倍鏡下可見均勻的淡藍(lán)色細(xì)條索狀染色，40倍鏡下可見藍(lán)染部位為肝上皮細(xì)胞間質(zhì)；LPS組與正常對(duì)照組比較，染色性狀與部位未見明顯改變；D+L組肝組織出現(xiàn)大量結(jié)節(jié)樣藍(lán)色深染，特別是在肝上皮細(xì)胞大量變性壞死區(qū)域，藍(lán)色深染充斥整個(gè)區(qū)域，細(xì)碎偏淡的條狀藍(lán)染已經(jīng)融合成粗大、深藍(lán)的結(jié)節(jié)樣改變。

3 討論

慢性肝損傷是一種多因素介導(dǎo)的復(fù)雜生物學(xué)過程，損傷的結(jié)果是肝細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死，損傷的誘因是多方面的[3]。ConA誘導(dǎo)(免疫性損傷)、對(duì)氨基酚藥物(藥物性損傷)和D-氨基半乳糖聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)(炎癥性損傷)等方法均可建立肝損傷動(dòng)物模型[4]。本實(shí)驗(yàn)采用D-氨基半乳糖聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)方法建立。D-氨基半乳糖誘發(fā)的動(dòng)物肝損傷在形態(tài)學(xué)和功能上被認(rèn)為與人的急性重癥肝炎類似。外源性脂多糖可增加氨基半乳糖的肝毒性, 同時(shí)氨基半乳糖也可導(dǎo)致脂多糖的感受性亢進(jìn)。氨基半乳糖和脂多糖可導(dǎo)致廣泛性肝壞死,較常用于肝炎藥物的研發(fā)[1]。但是兩種藥物聯(lián)合誘導(dǎo)的慢性肝損傷動(dòng)物模型，縱觀目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，較少，但是在臨床上，慢性肝損傷遠(yuǎn)多于急性肝損傷病人。因此，慢性肝損傷動(dòng)物模型的制備具有重要的研究意義。

脂多糖(LPS)是一種內(nèi)毒素，可活化單核巨噬細(xì)胞,在體內(nèi)主要通過脂多糖(LPS)結(jié)合蛋白、CD14等介導(dǎo)，與單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等靶細(xì)胞上的跨膜受體Toll樣受體4相結(jié)合，在淋巴細(xì)胞抗原96輔助下將信號(hào)轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，通過胞內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)途徑，導(dǎo)致TNF-α、IL-1、IL-6等炎性細(xì)胞因子及腫瘤壞死因子的產(chǎn)生，從而引起肝細(xì)胞損傷[5-6]。肝細(xì)胞內(nèi)許多物質(zhì)代謝過程與磷酸尿嘧啶核苷密切相關(guān),足量的磷酸尿嘧啶核苷是維持肝細(xì)胞正常代謝及生物轉(zhuǎn)化功能的必要物質(zhì),如果發(fā)生耗竭,可以引起肝細(xì)胞損傷甚至壞死。D-氨基半乳糖(D-GalN)是一種肝細(xì)胞磷酸尿嘧啶核苷干擾劑,通過競(jìng)爭(zhēng)生成二磷酸尿苷半乳糖使磷酸尿苷耗竭, 限制了細(xì)胞器的再生及酶的生成和補(bǔ)充，從而使細(xì)胞器受損，促使肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能均出現(xiàn)異常，導(dǎo)致物質(zhì)代謝障礙,引起肝細(xì)胞變性、壞死[7]，并且D-氨基半乳糖(D-GalN)還可能與脂多糖(LPS)協(xié)同作用，通過導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥的途徑造成肝細(xì)胞損傷，促使聚集在受損肝細(xì)胞周圍的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生暴發(fā)呼吸和脫顆粒，釋放氧自由基和導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，作用于肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷或死亡[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用這兩種藥物聯(lián)合的方法誘導(dǎo)慢性肝損傷的發(fā)生。

肝損傷動(dòng)物模型的建立是篩選保肝藥物的關(guān)鍵步驟之一。由于小鼠價(jià)格便宜,目前較多的文獻(xiàn)報(bào)道選用小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[2]。有關(guān)慢性肝損傷模型的研究結(jié)果不盡相同，原因在于慢性損傷過程需較長(zhǎng)的給藥時(shí)間，動(dòng)物個(gè)體差異大，在長(zhǎng)時(shí)間給藥過程中動(dòng)物對(duì)藥物的反應(yīng)差異越來越大，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的不穩(wěn)定性。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，在保證極低死亡率情況下，本實(shí)驗(yàn)采用30 mg/mL D-氨基半乳糖聯(lián)合2 μg/mL脂多糖混合溶液，采用連續(xù)腹腔注射法造模，每2天1次。研究報(bào)道，慢性肝損傷標(biāo)準(zhǔn)至少要求肝損傷狀態(tài)維持6 周以上，并伴有肝組織學(xué)的結(jié)構(gòu)病變，如肝纖維化和肝硬化結(jié)節(jié)等[9]；常用的肝纖維化動(dòng)物模型復(fù)制方法中，介紹給藥時(shí)間為9周[10]，綜上及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采取連續(xù)8周給藥的方法。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在8周時(shí)，雖然D+L組與正常對(duì)照組比較，ALT、AST水平均有明顯的上升趨勢(shì)，但AST/ALT顯著性降低，依然提示此時(shí)雖然有明顯的細(xì)胞膜和細(xì)胞器損傷，但該損傷以細(xì)胞膜變性改變?yōu)橹?表1、封底圖2)。

生理狀態(tài)下ALT與AST主要分布在肝臟的肝上皮細(xì)胞內(nèi)，血清含量極少。在肝細(xì)胞中，ALT主要存在于非線粒體中。只要肝上皮細(xì)胞細(xì)胞膜稍有損壞，就可以使血清中ALT水平特異性升高。因此，ALT被世界衛(wèi)生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測(cè)指標(biāo)。而大約80%的AST存在于線粒體內(nèi), 只有當(dāng)肝上皮細(xì)胞壞死時(shí)，血清中AST水平才會(huì)明顯升高[11]。

從組織形態(tài)學(xué)上，該模型也呈現(xiàn)出肝損傷的特征，壞死灶密集分布，枯否氏細(xì)胞顯著增多，小葉分界頗不清晰，結(jié)構(gòu)紊亂,結(jié)節(jié)狀增多，40倍鏡下可見結(jié)節(jié)性增生區(qū)域肝上皮細(xì)胞細(xì)胞核濃縮、溶解、壞死，壞死細(xì)胞處出現(xiàn)枯否氏細(xì)胞聚集。而在相同部位Masson染色可見大量結(jié)節(jié)樣藍(lán)色深染，特別是在肝上皮細(xì)胞大量變性壞死區(qū)域，藍(lán)色深染充斥整個(gè)區(qū)域，細(xì)碎偏淡的條狀藍(lán)染已經(jīng)融合成粗大、深藍(lán)的結(jié)節(jié)樣改變。

綜上本實(shí)驗(yàn)建立的慢性肝損傷小鼠模型不僅具有較好的穩(wěn)定性，而且具有明顯的生化、形態(tài)學(xué)、病理學(xué)特征。該模型的建立為研究慢性肝損傷的發(fā)病機(jī)制,探索慢性肝損傷治療新措施，篩選治療新藥物提供了新的選擇，具有重要意義。

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