孫秀萍，張曉萌，盧 聰，李翊華，劉新民

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類(lèi)動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021；2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 藥理毒理中心，北京 100193； 3.中國(guó)人民公安大學(xué)醫(yī)院，北京 100038； 4. 北京經(jīng)緯華清醫(yī)療設(shè)備科技公司， 北京 100101)

懸尾實(shí)驗(yàn)，是一種抗抑郁藥物活性篩選非常靈敏的行為學(xué)檢測(cè)方法[1]，也可用于抑郁癥病理生理機(jī)制的研究[2]。因其快速、方便，自1985年提出至今，被廣為接受和應(yīng)用[3]。該實(shí)驗(yàn)是將動(dòng)物頭部向下懸掛，動(dòng)物為克服不正常體位，首先產(chǎn)生以逃避為導(dǎo)向的劇烈掙扎運(yùn)動(dòng)，在經(jīng)過(guò)努力仍不能擺脫困境后，出現(xiàn)間斷性不動(dòng)，顯示“行為絕望”狀態(tài)。絕大多數(shù)抗抑郁藥物都可以減少動(dòng)物懸尾不動(dòng)時(shí)間，而且作用與臨床療效顯著相關(guān)[4]。

早期懸尾實(shí)驗(yàn)，以人工計(jì)時(shí)居多，工作量大，客觀性不強(qiáng)，不能定量分析動(dòng)物的掙扎強(qiáng)度。隨著信息、計(jì)算機(jī)、電子工程等技術(shù)和藥理學(xué)的交叉融合，其自動(dòng)化測(cè)量方法也逐漸發(fā)展起來(lái)。目前，國(guó)內(nèi)外懸尾測(cè)試儀的原理有3種，包括力傳感器、視頻測(cè)量及紅外熱釋電原理。國(guó)內(nèi)產(chǎn)品以視頻測(cè)量居多。視頻測(cè)量原理固然提供了更為直觀的顯示界面，但其測(cè)量誤差不容忽視，尤其實(shí)驗(yàn)動(dòng)物增至2只以上，視頻跟蹤的不準(zhǔn)確性尤為突出。紅外熱釋電原理易受外界環(huán)境溫度和動(dòng)物運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的影響，外界環(huán)境溫度過(guò)低或動(dòng)物運(yùn)動(dòng)遲緩時(shí)，經(jīng)常出現(xiàn)誤判現(xiàn)象，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。國(guó)外產(chǎn)品大多為傳感器原理[5]。該原理具有更高的靈敏性和準(zhǔn)確性。除“不動(dòng)時(shí)間”這一指標(biāo)外，動(dòng)物的掙扎強(qiáng)度也成為抗抑郁藥效的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。國(guó)外文獻(xiàn)經(jīng)常用“功”值表示動(dòng)物的掙扎強(qiáng)度[1]。與視頻及熱釋電原理相比，傳感器原理唯一可通過(guò)“功”指標(biāo)對(duì)動(dòng)物掙扎強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。國(guó)外產(chǎn)品均價(jià)格不菲，以測(cè)試6個(gè)樣本為例，價(jià)格在15～23萬(wàn)人民幣不等。盡管?chē)?guó)內(nèi)懸尾儀器市場(chǎng)巨大，但價(jià)格因素大大限制了國(guó)外產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)的廣泛應(yīng)用?；谝陨显?，我們采用力傳感器原理，研制了懸尾實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)分析處理系統(tǒng)，在硬件上進(jìn)行了改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了懸尾實(shí)驗(yàn)的自動(dòng)化，指標(biāo)敏感而且豐富，滿(mǎn)足了多樣本篩選的需求，現(xiàn)已應(yīng)用于抗抑郁藥物的篩選[6]。

1 材料和方法

1.1 硬件研制所需器材

計(jì)算機(jī)(9寸以上寬屏液晶顯示，奔騰雙核1.6G Hz以上，內(nèi)存1G以上，40 G及其以上硬盤(pán)，三個(gè)以上USB接口，刻錄光驅(qū))；測(cè)試箱(灰白色鋁合金材料)；傳感器；數(shù)據(jù)傳輸線，采集傳輸盒。

1.2 藥品

帕羅西汀 (paroxetine) 購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)為100357-200301；丙咪嗪 (imipramine) 購(gòu)自Sigma 公司，批號(hào)為010M01291V。上述藥物均于實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水溶解備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性C57BL/6J小鼠，20～24 g，SPF級(jí)，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)【SCXK(京)2004-0001】。動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK( 京) 2008-0019。動(dòng)物自由進(jìn)食進(jìn)水，維持12 h光照和12 h黑暗的晝夜節(jié)律。動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境一周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 硬件

采用力傳感器原理，采集動(dòng)物在懸掛過(guò)程中產(chǎn)生的張力變化。懸尾箱的設(shè)計(jì)，考慮采集自然光線，并最大程度避免周?chē)h(huán)境對(duì)動(dòng)物的干擾。在滿(mǎn)足技術(shù)和空間需求的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)多樣本檢測(cè)。力求實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同時(shí)懸掛的自動(dòng)化，節(jié)省人力，并保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的客觀性。

1.4.2 軟件

建立反映樣本活動(dòng)程度的數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及實(shí)時(shí)顯示處理技術(shù)。實(shí)驗(yàn)完成，每個(gè)樣本的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和分析結(jié)果按二進(jìn)制文件格式保存。除統(tǒng)計(jì)樣本的運(yùn)動(dòng)參數(shù)(運(yùn)動(dòng)時(shí)間和不動(dòng)時(shí)間)外，本系統(tǒng)提出“功”的概念，采用特定測(cè)量方法和數(shù)據(jù)處理算法，使之真實(shí)反應(yīng)動(dòng)物的掙扎程度。

1.4.3 懸尾實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)分析處理系統(tǒng)評(píng)價(jià)指標(biāo)的驗(yàn)證

1.4.3.1 運(yùn)動(dòng)閾值的確認(rèn)和數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性驗(yàn)證

C57BL/6J雄性小鼠50只，在測(cè)試房間適應(yīng)1 h后，進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)。將膠布粘在小鼠尾端1 cm處，再通過(guò)膠布，將小鼠懸掛于傳感器下方的掛鉤上。檢測(cè)懸尾箱、懸尾控制單元及計(jì)算機(jī)的連接，開(kāi)啟計(jì)算機(jī)，打開(kāi)懸尾測(cè)試軟件，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)參數(shù)設(shè)置，將實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)為6 min。通過(guò)調(diào)節(jié)固定手柄，降低橫梁，將動(dòng)物呈半懸掛狀態(tài)懸掛，升高橫梁，動(dòng)物呈完全懸掛狀態(tài)，點(diǎn)擊采集按鈕，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。運(yùn)動(dòng)閾值取16.8、26.8、36.8三個(gè)值，同時(shí)進(jìn)行人工不動(dòng)時(shí)間的統(tǒng)計(jì)。采用SPSS 16.0，首先觀察散點(diǎn)圖是否存在線性相關(guān)，再進(jìn)行相關(guān)分析。

1.4.3.2 抗抑郁陽(yáng)性藥對(duì)“不動(dòng)時(shí)間”及“功”指標(biāo)的驗(yàn)證

圖1 懸尾實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)分析處理系統(tǒng)示意圖

C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為3組，即空白對(duì)照組(蒸餾水)、帕羅西汀組(10 mg/kg)、丙咪嗪組(10 mg/kg)，每組10只。各組均給予0.2 mL/10g，單次給藥后 1 h 進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法同1.4.3.1。采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。采用單樣本K-S檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，不滿(mǎn)足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。組間差異采用LSD(方差齊)或 Games-Howell(方差不齊)法，P< 0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 懸尾實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)分析處理系統(tǒng)的建立

2.1.1 測(cè)試箱：測(cè)試箱由8個(gè)懸尾箱組成，尺寸為72× 36×16 cm(長(zhǎng)×寬×高)。懸尾箱采用灰白色鋁合金材料制成，尺寸為18×18×16 cm (長(zhǎng)×寬×高)。懸尾箱采用四周封閉、頂面開(kāi)放的形式，既可避免周?chē)h(huán)境干擾，又可采集自然光線。懸尾箱體設(shè)計(jì)緊湊，節(jié)省空間。通過(guò)旋轉(zhuǎn)固定手柄，調(diào)節(jié)懸尾桿高度，實(shí)現(xiàn)多樣本同時(shí)懸掛。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，將懸尾桿降至最低，動(dòng)物通過(guò)掛鉤懸掛于傳感器下方，此時(shí)，動(dòng)物前肢著地，處于半懸掛狀態(tài)。所有動(dòng)物懸掛完畢后，調(diào)節(jié)固定手柄，使懸尾桿上升至所需高度，此時(shí)，所有動(dòng)物同時(shí)處于完全懸掛狀態(tài)。懸尾實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)分析處理系統(tǒng)見(jiàn)圖1。

圖2 信號(hào)采集傳輸示意圖

圖3懸尾實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)分析處理系統(tǒng)軟件界面圖

2.1.2 傳感器與信號(hào)調(diào)理單元：8個(gè)傳感器固定于橫梁兩側(cè)，分別對(duì)應(yīng)8個(gè)懸尾箱。傳感器的輸出經(jīng)過(guò)增益調(diào)整、濾波處理送至采集傳輸盒。

2.1.3 采集傳輸裝置：

采集傳輸盒采集信號(hào)調(diào)理單元的輸出信號(hào)，數(shù)字化后送往PC機(jī)。采集傳輸過(guò)程如下(圖2)

2.2 軟件設(shè)計(jì)

軟件系統(tǒng)包括實(shí)驗(yàn)基本參數(shù)設(shè)置、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析三大部分。

實(shí)驗(yàn)基本參數(shù)設(shè)置完成后，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。軟件讀取數(shù)字化處理后的原始數(shù)據(jù)，以波形及數(shù)字的形式，實(shí)時(shí)顯示八只懸尾小鼠的運(yùn)動(dòng)時(shí)間和不動(dòng)時(shí)間。本系統(tǒng)除了可以提取傳統(tǒng)指標(biāo)“不動(dòng)時(shí)間”外，還可以提取“功”值，用于反應(yīng)動(dòng)物的掙扎強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以Excel的形式生成，便于用戶(hù)在Excel、SPSS、SAS等分析統(tǒng)計(jì)軟件中作進(jìn)一步分析處理。同時(shí)，軟件可進(jìn)行波形回放；閾值可調(diào)，從而實(shí)現(xiàn)結(jié)果再分析。軟件界面圖如圖3所示。

2.3 懸尾實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)分析處理系統(tǒng)評(píng)價(jià)指標(biāo)的驗(yàn)證

2.3.1 運(yùn)動(dòng)閾值的確認(rèn)和數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性驗(yàn)證

運(yùn)動(dòng)閾值為16.8、26.8、36.8時(shí)，人工計(jì)時(shí)與懸尾測(cè)試軟件的相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。當(dāng)運(yùn)動(dòng)閾值為26.8時(shí)，人機(jī)相關(guān)系數(shù)(person correlation)最大，為0.94，雙側(cè)P=0.000，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)此進(jìn)行了10余次數(shù)據(jù)驗(yàn)證，結(jié)果類(lèi)似，證明懸尾測(cè)試軟件能準(zhǔn)確真實(shí)的反應(yīng)動(dòng)物的懸尾行為。

表1 人工計(jì)時(shí)與懸尾測(cè)試軟件的相關(guān)系數(shù)

圖4 丙咪嗪、帕羅西汀對(duì)懸尾不動(dòng)時(shí)間的影響(mean±SEM，**P < 0.01，與正常組比較)

圖5 丙咪嗪、帕羅西汀對(duì)小鼠懸尾狀態(tài)下“功”值的影響(mean±SEM，**P < 0.01，與正常組比較)

2.3.2 陽(yáng)性藥對(duì)“不動(dòng)時(shí)間”及“功”指標(biāo)的驗(yàn)證

由圖4可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，丙咪嗪、帕羅西汀可顯著縮短懸尾不動(dòng)時(shí)間(P< 0.01)。

圖5結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，帕羅西汀可顯著增加懸尾小鼠“功”值(P< 0.01)。

3 討論

本研究提供了一套具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的適用于小鼠的懸尾實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)分析處理系統(tǒng)。該系統(tǒng)以傳感器為原理，具有高度靈敏性和穩(wěn)定性，并建立了反應(yīng)小鼠掙扎強(qiáng)度的“功”指標(biāo)，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)以傳感器為原理的懸尾測(cè)試儀研發(fā)的空白。

目前，國(guó)內(nèi)外懸尾測(cè)試儀的原理有三種，包括傳感器、視頻原理及紅外熱釋電原理。視頻原理，經(jīng)常采用質(zhì)心跟蹤的方法，但對(duì)懸尾實(shí)驗(yàn)并不合適。因?yàn)閯?dòng)物在懸吊過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生以逃避為導(dǎo)向的運(yùn)動(dòng)，但質(zhì)心變化可能并不明顯，質(zhì)心跟蹤的方法顯然不能有效識(shí)別動(dòng)物的“動(dòng)”和“不動(dòng)”狀態(tài)。識(shí)別鼠足，是簡(jiǎn)單、有效的跟蹤方法，但要求動(dòng)物腹部必須始終對(duì)準(zhǔn)攝像頭。另外，動(dòng)物掛在懸尾箱內(nèi)，對(duì)背景光的強(qiáng)度和穩(wěn)定性有一定要求，并且需要避免反光。其次，一般情況下，攝像頭距離懸尾箱30 cm左右，跟蹤效果比較理想，但僅限于一個(gè)樣本的觀察。增加攝像頭和懸尾箱的距離，可以增加樣本數(shù)，即跟蹤兩個(gè)或兩個(gè)以上的動(dòng)物。但隨著攝像頭和懸尾箱距離的加大，識(shí)別效果變差。廣角鏡頭也不能有效解決這一問(wèn)題。由此可見(jiàn)，視頻跟蹤的原理，并不適于懸尾儀器的研發(fā)。Juszczak[7]曾于2006年發(fā)表懸尾視頻分析的文章，但此后，視頻跟蹤的原理在國(guó)外并未大規(guī)模應(yīng)用于懸尾儀器。紅外熱釋電原理則易受外界環(huán)境溫度和動(dòng)物運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的影響，外界環(huán)境溫度過(guò)低或動(dòng)物運(yùn)動(dòng)遲緩時(shí)，經(jīng)常出現(xiàn)誤判現(xiàn)象，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。傳感器原理能夠檢測(cè)到極微小的張力變化(如動(dòng)物呼吸、胃腸蠕動(dòng)等引起的張力變化)，具有極高的靈敏性和穩(wěn)定性，不受動(dòng)物狀態(tài)、背景光的限制，在空間允許的情況下，可用于多樣本檢測(cè)，非常適于動(dòng)物懸尾運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的跟蹤。因此，我們選擇了力傳感器原理研制本系統(tǒng)，并通過(guò)閾值設(shè)定等方式，取得了敏感、穩(wěn)定的指標(biāo)。

懸尾實(shí)驗(yàn)，主要用于抗抑郁藥物的篩選。因此，必須滿(mǎn)足多樣本要求。同時(shí)，實(shí)現(xiàn)多樣本同時(shí)懸掛也是亟待解決的問(wèn)題。本系統(tǒng)通過(guò)橫梁的自動(dòng)升降，解決了這一問(wèn)題，節(jié)省了人力，并保證了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的客觀性。另外，建立自然光線下安靜、穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，是保證行為學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性的先決條件。國(guó)內(nèi)外的懸尾儀器產(chǎn)品，懸尾箱的設(shè)計(jì)均為側(cè)面開(kāi)放，動(dòng)物易受周?chē)h(huán)境的干擾。本系統(tǒng)懸尾箱采用四周封閉，頂面開(kāi)放的形式，既避免了周?chē)h(huán)境的干擾，同時(shí)，又可采集自然光線，保證了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。除統(tǒng)計(jì)樣本的運(yùn)動(dòng)參數(shù)(運(yùn)動(dòng)時(shí)間和不動(dòng)時(shí)間)外，本系統(tǒng)提出了“功”的概念，用于反應(yīng)動(dòng)物的掙扎強(qiáng)度，從而更細(xì)致地反應(yīng)抗抑郁藥物的藥效。

保證懸尾實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分析處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，是該儀器研發(fā)最為重要的環(huán)節(jié)之一。通過(guò)人機(jī)數(shù)據(jù)相關(guān)性分析對(duì)系統(tǒng)提供的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性驗(yàn)證，是儀器研發(fā)最為基本和最為重要的工作[8]。通過(guò)SPSS相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析，我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)運(yùn)動(dòng)閾值設(shè)為26.8時(shí)，人機(jī)相關(guān)系數(shù)達(dá)94%，雙側(cè)P=0.000，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明懸尾測(cè)試軟件能準(zhǔn)確真實(shí)的反應(yīng)動(dòng)物的懸尾行為。

丙咪嗪為三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥物，經(jīng)常作為陽(yáng)性藥應(yīng)用于抑郁癥相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究[9]。帕羅西汀為5-羥色胺重?cái)z取抑制劑，具有高效、強(qiáng)力的抗抑郁作用，可顯著縮短懸尾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不動(dòng)時(shí)間[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，丙咪嗪和帕羅西汀的抗抑郁作用在懸尾實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)分析處理系統(tǒng)中可得到良好體現(xiàn)，驗(yàn)證了該系統(tǒng)的有效性。帕羅西汀還使小鼠“功”值增加，即增強(qiáng)懸尾小鼠的掙扎強(qiáng)度，顯示了其強(qiáng)有效的抗抑郁作用。丙咪嗪未表現(xiàn)出該作用。

綜上所述，基于傳感器原理，研制了懸尾實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分析處理系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了懸尾實(shí)驗(yàn)的自動(dòng)化，客觀化，重復(fù)性好，人機(jī)數(shù)據(jù)高度相關(guān)，指標(biāo)敏感，并增加了“功”和“功率”等反應(yīng)懸尾動(dòng)物掙扎強(qiáng)度的指標(biāo)，使抗抑郁藥物活性評(píng)價(jià)更加細(xì)致，可推廣應(yīng)用于抗抑郁藥物篩選和抑郁癥病理機(jī)制的研究。

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