劉月環(huán)，王志遠(yuǎn)，杜江濤，余 強(qiáng)，余陳歡，吳舊生，應(yīng)華忠

(1.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，杭州 310013；2.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州 310029)

高脂血癥及脂肪肝是較常見的疾病，主要是由脂代謝紊亂引起，是導(dǎo)致心腦血管疾病重要的危險(xiǎn)因子之一[1]。隨著人們生活水平的提高及西方飲食文化的滲入，目前該病的發(fā)病率在我國發(fā)達(dá)地區(qū)有時(shí)高達(dá)50%[2-3]，因此研究該病的發(fā)生機(jī)制，尋找高效的防治靶點(diǎn)，篩選藥物，培育和建立具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的特色動(dòng)物模型，成為生物醫(yī)藥及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行業(yè)一個(gè)意義重大的科學(xué)課題。

現(xiàn)已知除少數(shù)高脂血癥(繼發(fā)性高脂血癥)是由于全身性疾病所致外，絕大多數(shù)原發(fā)性高脂血癥是因遺傳基因缺陷(或與環(huán)境因素相互作用)引起。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)部分高脂血癥患者存在單一或多個(gè)基因的缺陷，多具有家族聚集性，有明顯的遺傳傾向，臨床上稱為家族性高脂血癥：家族性高膽固醇血癥，如家族性載脂蛋白B100缺陷癥；家族性混合型高脂血癥；家族性異常β-脂蛋白血癥等[4]?，F(xiàn)有的研究表明，存在一種或數(shù)種基因能決定個(gè)體是否發(fā)生高脂血癥。其次，某些基因可能影響個(gè)體對(duì)高脂血癥的易感性。這些基因可能先天遺傳獲得，也可能是后天與環(huán)境因素的相互作用中由基因突變而形成[5]。最近的研究認(rèn)為，由于飲食作為一種環(huán)境因素與遺傳易感性相互作用，在與脂蛋白代謝異常和心血管疾病發(fā)生的關(guān)鍵蛋白中，ApoE的影響最大[6]。ApoE蛋白可能對(duì)脂蛋白代謝起雙向調(diào)節(jié)作用，其結(jié)構(gòu)變異或ApoE基因多態(tài)性可能導(dǎo)致脂蛋白代謝異常[7]。

自上個(gè)世紀(jì)六十年代以來，國內(nèi)外學(xué)者就高脂飼料誘發(fā)的長爪沙鼠高脂血癥的研究結(jié)果表明，該動(dòng)物以其成模時(shí)間短(只需要四周)、性狀典型(與人類高脂血癥極為相似)、飼料配方簡便(如不需要甲狀腺抑制藥物)而著稱[8-9]。長爪沙鼠高脂血癥的表型與人類較為相似，但遺傳基礎(chǔ)不清。筆者為弄清該表型的遺傳原因，從篩選主基因和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)標(biāo)記，培育高脂血癥的新品系出發(fā)，通過幾年的努力，克隆到了沙鼠的ApoE基因[10]，探明誘發(fā)模型組，正常組及8月齡以上自發(fā)型性高脂血癥組等三類動(dòng)物該基因CDS區(qū)均存在97位(C→T)，781位(G→T)，1774位(A →T)等3個(gè)變異位點(diǎn)，這些突變還導(dǎo)致了蛋白質(zhì)序列中產(chǎn)生了11位(信號(hào)肽區(qū))丙氨酸(Ala)到纈氨酸(Val)的突變，65位亮氨酸(leu)到亮氨酸(leu)的突變，256位賴氨酸(Lys)到蛋氨酸(Met)的突變。本研究為驗(yàn)證這三個(gè)SNP在兩個(gè)級(jí)別Z：ZCLA封閉群中的分布情況，在對(duì)全群遺傳概貌進(jìn)行評(píng)價(jià)的同時(shí)，也評(píng)價(jià)其作為遺傳標(biāo)記的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

實(shí)驗(yàn)用長爪沙鼠由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SCXK(浙)2008-0034，SYXK(浙)2008-0114，商品化飼料參照GB14923-2010生產(chǎn))。PCR試劑rTaq酶及marker全套試劑購自Takara公司，PCR產(chǎn)物送上海華津和上海英竣公司測序，電泳試劑皆國產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)

表1 篩選SNP所用引物表

1.3 PCR-SSCP反應(yīng)條件和程序

五對(duì)引物的擴(kuò)增都采用15 μL反應(yīng)體系，包括：0.4 μL DNA模板，鎂離子濃度為0.9 mmol ((P1)；1.5 mmol (P2, P5)；1.2 mmol (P3, P4)，1.2 μL dNTPs(10 mmol/mL)，上下游引物各0.6 μL(10 mM)，0.075 μL (5U/μL) Taq酶。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，然后循環(huán)30次，每一循環(huán)包括：94℃變性30 s，59℃(P1, P2, P4, P5)或60℃(P3)解鏈30 s，然后72℃延伸30 s，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min，最后4℃結(jié)束反應(yīng)。擴(kuò)增后2.5%的瓊脂糖凝膠(含EB染色液)電泳觀察并拍照。然后用非變性聚丙烯酰胺凝膠SSCP檢測，電泳取5μL PCR產(chǎn)物與5 μL 6× 變性上樣緩沖液(98% 甲酰胺、0.025%溴酚藍(lán)、10 mmol/L EDTA(pH8.0)，10%甘油)混勻．置PCR儀中95 ℃變性5 min，迅速放入冰浴中20 min，冷卻后點(diǎn)樣。采用8%～12%(P1為10%, P2為8%, P3-5為12%)非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺=99:1)，電泳緩沖液為0.5×TBE，180 V電泳1 h 15 min。電泳結(jié)束后，取下膠標(biāo)記方向后放在搖床染槽里進(jìn)行染色。步驟是：在含9.6%的乙醇和0.5% 的冰醋酸的固定液中固定10 min，去離子水清洗2 min，0.1%的硝酸銀中染色10 min，然后去離子水中清洗10 min，在含有1.5% NaOH和0.4%甲醛的顯色液中顯色，直至條帶清晰為止，采用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)照相保存。

圖1 781位點(diǎn)基因型的PCR-SSCP圖譜781位(G→T)，泳道4、9為GG型；泳道1、5、7、8、10為GT型；泳道2、3、6為TT型.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

根據(jù)經(jīng)典的數(shù)量遺傳學(xué)和群體遺傳學(xué)公式計(jì)算如下指標(biāo)：

等位基因頻率(allele frequency)與基因型頻率(genotypic frequency)。 按Nei和Roychoudhurg (1974)[11]方法計(jì)算位點(diǎn)的雜合度其中H為平均位點(diǎn)雜合度，Pi為第i個(gè)等位基因的頻率，r為SNP位點(diǎn)數(shù)，m為等位基因數(shù))。按Bostein等(1980)[12]方法計(jì)算多態(tài)信息量(polymorphism information content，PIC)PIC=1-為位點(diǎn)平均多態(tài)信息量，r為SNP位點(diǎn)數(shù)，Pi，Pj分別為第i個(gè)、第j個(gè)等位基因的頻率，m為等位基因數(shù))。計(jì)算有效等位基因數(shù) (effective number of allele，Ne)，其中Pi為第i個(gè)等位基因的頻率，Ne為平均有效等位基因，r、m同上。以每個(gè)個(gè)體純合位點(diǎn)占總檢測座位的比率來計(jì)算基因純合度 (individual gene homogeneity)。

2 結(jié)果

2.1 突變基因頻率、基因型頻率分布

利用5對(duì)PCR-SSCP引物對(duì)ApoE基因的進(jìn)行了多態(tài)性掃描，結(jié)果顯示P1、P2和P5的PCR產(chǎn)物具有多態(tài)性，分別是97位(C→T)、781位(G→T)、1774位(A→T)(圖1)。其中P1發(fā)現(xiàn)三種基因型(CT、CC、TT)；P2發(fā)現(xiàn)三種基因型(GG、GT、TT)，P5只有二種基因型(AT、AA),在檢測的群體中沒有發(fā)現(xiàn)TT基因型個(gè)體。對(duì)于PCR條帶及SSCP聚丙烯酰胺電泳結(jié)果不佳者予以剔除，結(jié)果列于表2。ApoE基因三個(gè)SNP的六個(gè)等位基因在兩個(gè)級(jí)別的群體中分布都不平衡，其中群體內(nèi)發(fā)生97位(C→T)的突變，等位基因C的在世代間、微生物控制級(jí)別間、性別間及年齡間的頻率均達(dá)0.95以上，占絕對(duì)優(yōu)勢，而雜合子僅在普通環(huán)境飼養(yǎng)的49代雌鼠中存在5只，屏障環(huán)境中未發(fā)現(xiàn)；而在781位(G→T)和 1774位(A→T)的突變則相對(duì)均衡，主要原因是雜合子占有相當(dāng)數(shù)量，但1774突變中沒有TT型純合子，781位的雜合子占了絕大多數(shù)，相對(duì)平衡。

2.2 雜合度、多態(tài)信息量、純合度多態(tài)性分析

在本研究群體中，通過考察不同微生物控制級(jí)別的兩個(gè)群體、不同世代、不同性別、不同年齡，我們得到了97位點(diǎn)、781位點(diǎn)和1774位點(diǎn)的平均等位基因?yàn)?個(gè)(表3)，遺傳方式基本符合孟德爾定律；期望雜合度分別是0.063、0.501、0.499，全群平均為0.354；PIC分別是0.061、0375、0.374，全群平均0.270，表明在C97T上屬于低度多態(tài)，在G781T，A1774T上屬于中度多態(tài)。

3 討論

載脂蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)的 SNPs 單倍型與血漿 TG水平、TC 水平相關(guān)已有較多報(bào)道[13]，ApoC3 上游區(qū) -482T/C 多態(tài)性、ApoA5 上游區(qū) -1131T/C、-3A/G多態(tài)性與 TG 水平強(qiáng)相關(guān)[14-5]；Pullinger 等[16]證實(shí)了 ApoA5 基因553G>T(rs2075291)對(duì)美國的中國血統(tǒng)和非中國血統(tǒng)的人種血漿 TG代謝的影響。Chien 等[17]發(fā)現(xiàn)ApoA1-75G>A、ApoA1 83C>T、ApoC3 3175C>G、ApoC3 3206G>T、ApoA4 127A>G 和 ApoA5 553G>T 與高TG的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在中國人群中，這些多態(tài)性位點(diǎn)及其單倍型與HTG/HDL 的比值有關(guān)系。Ribalta等[18]發(fā)現(xiàn) ApoC3 基因第 3 外顯子 -1100-T/A 多態(tài)位點(diǎn)與家族性混合型高脂血癥患者 VLDL 和 IDL 顆粒的數(shù)目的增多有關(guān)。

ApoE蛋白在人上已發(fā)現(xiàn)了三種變異體，分別與人高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化易感性相關(guān)[19]，已在各國各人種上有相當(dāng)多的報(bào)道[20-21]，國內(nèi)也有多個(gè)民族多個(gè)地區(qū)的報(bào)道[22-23]。關(guān)于該基因的SNP報(bào)道也有在內(nèi)含子區(qū)發(fā)現(xiàn)有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的序列[24]，ApoE基因型與ApoC3 基因 -482C>T、-455T>C 和3238C>G 多態(tài)性及與血漿脂類的參數(shù)的關(guān)聯(lián)關(guān)系[25]。而在豬上也已發(fā)現(xiàn)了7個(gè)SNP[26]，啟動(dòng)子區(qū)也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可以調(diào)節(jié)ApoE基因起始轉(zhuǎn)錄的SNP[27]，但其多態(tài)性和堿基突變與編碼蛋白構(gòu)象及功能的關(guān)系，除了人外，大小鼠尚無報(bào)道。

表2 三個(gè)SNP的基因型頻率和等位基因頻率

表3 兩種飼養(yǎng)環(huán)境下長爪沙鼠群體在三個(gè)SNP位點(diǎn)上的雜合度和PIC

x2是檢測哈迪溫伯格平衡，*表示P< 0.05，**表示P< 0.01，表示兩個(gè)位點(diǎn)上全群都未達(dá)哈迪溫伯格平衡。

Chi-square was used to detect Hardy-Weinberg balance,** presented that the Chi-square was significant at 0.01 level.

P1, 2和5的PCR產(chǎn)物具有多態(tài)性,其中P1發(fā)現(xiàn)三種基因型(CT、CC、TT)；P2發(fā)現(xiàn)三種基因型(GG、GT、TT)，P5只有二種基因型(AT、AA),這些突變導(dǎo)致了蛋白質(zhì)序列中產(chǎn)生了11位(信號(hào)肽區(qū))丙氨酸(Ala)到纈氨酸(Val)的突變，65位亮氨酸(leu)到亮氨酸(leu)的突變，256位賴氨酸(Lys)到蛋氨酸(Met)的突變，三個(gè)突變并未導(dǎo)致氨基酸極性的改變，由此認(rèn)為，突變后的氨基酸對(duì)編碼蛋白可能無影響，但需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

Z:ZCLA長爪沙鼠ApoE基因在群體內(nèi)發(fā)生97位(C→T)突變，等位基因C的在世代間、微生物控制級(jí)別間、性別間及年齡間的頻率均達(dá)0.95以上，占絕對(duì)優(yōu)勢，主要原因是雜合子過少，而雜合子僅在普通環(huán)境飼養(yǎng)的49代雌鼠中存在5只，屏障環(huán)境中未發(fā)現(xiàn)；而在781位(G→T)，1774位(A→T)的突變則相對(duì)均衡，主要原因是雜合子占有相當(dāng)數(shù)量，但1774突變中沒有TT型純合子，筆者以為可能是純合致死或檢測的群體有效含量不夠大，781位的雜合子占了絕大多數(shù)，導(dǎo)致ApoE基因頻率和基因型分布不平衡，這些是否跟保種的選擇及生活適應(yīng)能力的大小有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。根據(jù)ApoE基因各等位基因在全群中的分布頻率及PIC值得出全群目前在中度多態(tài)，這或許與該群體封閉繁育了30多年有關(guān)。根據(jù)三個(gè)SNP在各個(gè)世代中的分布情況推斷，這三個(gè)SNP遺傳符合孟德爾定律，具備作為遺傳標(biāo)記的基礎(chǔ)，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行遺傳力的評(píng)估后決定是否可用于選種。

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