劉春杰等

【摘 要】本試驗(yàn)采用瓊脂平板打孔灌藥法，根據(jù)中獸醫(yī)理論選擇當(dāng)歸、川芎、金銀花等20味中草藥對奶牛乳腺炎3種主要致病菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)。并測定所篩選的11味中藥的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)歸、川芎、蒲公英、川紅花、白術(shù)、金銀花6味中藥對奶牛乳腺炎3種病原菌的綜合抑菌效果較好，此結(jié)果為進(jìn)一步研制治療奶牛乳腺炎復(fù)方中藥制劑提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

【關(guān)鍵詞】中草藥；奶牛乳腺炎；病原菌；抑菌試驗(yàn)

【Abstract】This study was adopted flat hole filling method， selected the Angelica， Chuanxiong， Dandelion， Honeysuckle and other 20 kinds of herbal medicine on the cow mastitis causing 3 kinds of main pathogenic bacteria in vitro antibacterial test. Determination of minimum inhibitory concentration and the screening of 11 traditional Chinese medicines and two groups of formula （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC）. The test results show that 3 kinds of pathogenic bacteria of dairy cow mastitis can be effectly suppressed by Angelica， Chuanxiong， Dandelion， Safflower， Atractylodes， Honeysuckle. It will could be provide experimental data for the further development of the treatment of mastitis compound Chinese medicine preparation.

【Key words】Chinese herbs；Dairy cow mastitis； Pathogenic bacteria； Antibacterial test

奶牛乳腺炎是危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)最常見的疾病之一，雖然對其研究已經(jīng)有150多年的歷史，取得了一些令人可喜的成果，但仍然是當(dāng)今奶牛場難以控制的疾病，給奶牛養(yǎng)殖帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，包括治療費(fèi)用、牛奶廢棄增加的勞動(dòng)量、奶產(chǎn)量的下降、母牛過早淘汰、奶品質(zhì)下降等。據(jù)報(bào)道引起奶牛乳腺炎的主要致病菌有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌等。自抗生素在臨床應(yīng)用以來，人們大量應(yīng)用抗生素治療奶牛乳腺炎，使該病的防治有了巨大的突破。由于抗生素的濫用致使病原菌的抗藥性增強(qiáng)且導(dǎo)致高藥物殘留等問題的發(fā)生[1]。中草藥屬于天然藥物，對人類及動(dòng)物無毒副作用且不易產(chǎn)生抗藥性，藥物殘留相對低等優(yōu)勢。因此篩選對病原微生物抑菌強(qiáng)度大、特異性高、對環(huán)境穩(wěn)定的中草藥來防治奶牛乳腺炎是發(fā)展奶牛業(yè)的一項(xiàng)重要課題。本試驗(yàn)?zāi)康脑谟诤Y選對奶牛乳腺炎致病菌敏感的中草藥，為中獸醫(yī)臨床防治乳腺炎打下基礎(chǔ)[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，鏈球菌是本研究室從長春及其周邊地區(qū)患乳腺炎奶牛的牛乳中分離純化鑒定得到。

1.1.2 藥物

金銀花、大青葉、川紅花、蒲公英、桃仁、訶子、秦皮、炮姜、益母草、當(dāng)歸、白芍、枳殼、紅花、黃芩、黃芪、熟地、魚腥草、地榆等均購自長春市吉林大藥房。

1.1.3 主要器材

上海智誠生化培養(yǎng)箱、蘇州凈化設(shè)備有限公司超凈工作臺，青島海爾4℃冰箱、德國賽多利斯電子天平、日本三洋立式高壓滅菌鍋、上海新苗數(shù)顯式鼓風(fēng)干燥箱、可調(diào)溫電爐、電子恒溫水浴鍋、高速離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、移液槍等。

1.1.4 藥品與試劑

營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、小牛血清的制備按有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行[3]。

1.2 方法

1.2.1 中藥制備

分別取20味中草藥各100g，首次加水1000mL，浸泡2h后煮沸，后文火煮60min。4層紗布濾過藥液。所剩濾渣加水500mL再次煎煮60 min，濾過并棄去藥渣，合并2次濾過藥液，經(jīng)過蒸發(fā)、抽濾、烘干，濃縮至50mL，使其終濃度為1g/mL，濃縮后分別裝入有塞廣口瓶，用封口膜封口，貼上標(biāo)簽，120℃30min滅菌，-20℃凍存。正式試驗(yàn)時(shí)用生理鹽水配成所需濃度，4℃保存待用[1， 4-5]。

1.2.2 菌種培養(yǎng)

試驗(yàn)所用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌擴(kuò)增采用普通肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行，用2%小牛血營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)鏈球菌。菌株接種后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待菌種復(fù)壯后使用。將復(fù)壯后的大腸桿菌接種到含10mL肉湯培養(yǎng)基的試管中，37℃恒溫培養(yǎng)6h；金黃色葡萄球菌接種到含l0mL肉湯培養(yǎng)基的試管中，37℃恒溫培養(yǎng)18h；鏈球菌接種到10mL血清肉湯培養(yǎng)基的試管中，37℃恒溫培養(yǎng)18h。將肉湯培養(yǎng)擴(kuò)增的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌用肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行1：500稀釋備用。鏈球菌用小牛血清肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行l(wèi)：5稀釋備用[6]。

1.2.3 20種中草藥體外抑菌試驗(yàn)

體外抑菌試驗(yàn)采用瓊脂平板打孔灌藥法進(jìn)行。取稀釋后的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌液各200μL，用“L”型玻璃棒均勻涂抹于普通瓊脂平板上；鏈球菌200μL均勻涂于小牛血清瓊脂板上。然后待菌液被吸收后在平板上用直徑為6mm打孔器打孔4孔/板，孔間距為20mm，挖出瓊脂，注入受試藥液40μL/孔，每藥2個(gè)重復(fù)對照孔加蒸餾水，37℃培養(yǎng)24h后分別測量抑菌圈直徑大小，每孔測量2次，最終取兩孔共4次直徑測量的平均值[3]。

1.2.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

抑菌圈直徑Ф≥16mm為極度敏感；16mm≥Ф≥10mm為高度敏感；10mm≥Ф≥7mm小于為低敏感；7mm≥Ф為不敏感；無抑菌圈為耐藥[8]。

1.2.5 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）測定

從體外抑菌試驗(yàn)中選出11味對3種致病菌高度敏感的中藥采用試管法測定其MIC和MBC[4]。每種藥液用10支試管。試管中注入普通營養(yǎng)肉湯（用于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）或血清營養(yǎng)肉湯（用于鏈球菌）lmL。將lmL滅菌藥液注入第l支試管，用移液槍吹打3下，混勻后吸取1ml注入第2支試管，倍比稀釋，依此類推，到第9管時(shí)吸出1mL棄掉，第10管不加藥液只加1mL純培養(yǎng)基。隨后分別在這10個(gè)試管中注入0.1mL菌液（含菌量為107/mL），吹打混和均勻。置37℃培養(yǎng)24h后觀察混濁度。從試管外觀察，透明、無混濁為此藥最小抑菌濃度（MIC）。從其中吸取10μL培養(yǎng)物接種于小牛血清瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)36h計(jì)數(shù)菌落數(shù)。3個(gè)視野無菌落為無菌生長。此管中藥物的濃度為此藥的最小殺菌濃度。

2 結(jié)果

2.1 20味中藥體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

從表1看出：川紅花、金銀花、白術(shù)、黃芩、茯苓、當(dāng)歸、川芎對3種病原菌都有不同程度的抑菌作用；熟地、大青葉、白芍、地榆僅對金葡菌和鏈球菌有抑菌作用；枳殼僅對金葡菌和大腸桿菌有抑菌作用，對鏈球菌無抑菌作用。

2.2 11味中藥的MIC和MBC的測定結(jié)果

11種中藥的MIC和MBC的測定結(jié)果見表2。

由表2可以看出，當(dāng)歸、川芎、蒲公英、川紅花、白術(shù)、金銀花對3種病原菌都有明顯的殺滅效果。熟地、大青葉、白芍對金葡菌和鏈球菌有明顯的殺滅效果。魚腥草、枳殼對金葡菌和大腸桿菌有明顯的殺滅效果作用。

3 討論

從以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，能夠抑制奶牛乳腺炎3種主要病原菌的中草藥有很多，其中，當(dāng)歸、川芎、蒲公英、川紅花、白術(shù)、金銀花等有效殺滅引起奶牛乳腺炎的病原菌。說明應(yīng)用中草藥治療奶牛乳腺炎有著很好的應(yīng)用前景，而且為有效的中藥復(fù)方制劑研究奠定基礎(chǔ)[9]。

根據(jù)有關(guān)報(bào)道中草藥能夠有效抑制細(xì)菌的生長，其抗菌作用比抗生素強(qiáng)l000倍。但由于所使用的中草藥品質(zhì)相差懸殊及復(fù)合方劑進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)難以達(dá)到高效的體內(nèi)抑菌濃度，使中草藥的治療效果欠佳。其中也與中草藥抗菌的有效活性成分在體內(nèi)和體外的環(huán)境不同引起藥物抗菌能力下降有關(guān)，這也與動(dòng)物體內(nèi)消化液、酶、激素等化學(xué)成分對其影響較大有關(guān)，從而使很大部分中藥沒有達(dá)到與抗生素一樣的效果。另外，中藥不僅具有抗菌作用，還有抗炎作用和調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫的作用，因此，在選擇防治奶牛乳腺炎的中草藥時(shí)，不僅要進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)篩選，還要將挑選出來的中草藥進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)抑菌試驗(yàn)以確保藥物的安全、有效。

【參考文獻(xiàn)】

[1]魏彥.淺談中藥湯劑制法[J].中藥研究與信息，2002，4（7）：52-3.

[2]白峰，王文魁，王廣彬，等.22味中草藥對3種奶牛乳腺炎病原菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2009（05）：5-7.

[3]馬保臣，李建基，劉翠艷.17種中藥對奶牛乳腺炎4種病原菌的抑菌試驗(yàn)[J].中國獸醫(yī)雜志，2003（07）：28-9.

[4]丁月云，李茜，王恬.21種中藥對奶牛乳房炎3種病原菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].畜牧與獸醫(yī)，2004，（12）：5-7.

[5]王廣彬，劉耀偉，白峰，等.桉葉、艾葉對奶牛乳房炎主要病原菌的體外抑菌效果[J].廣西畜牧獸醫(yī)，2008（05）：296-7.

[6]李亞林，段曉琴，簡子健，等.中草藥對奶牛臨床型乳腺炎病原菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].畜禽業(yè)，2008（02）：58-60.

[7]徐叔云，卞如濂，陳修.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].2002.

[8]郁建生，周芳英.20種中草藥制劑抑菌試驗(yàn)初報(bào)[J].中獸醫(yī)學(xué)雜志，1995（1）：2-4.

[9]易湘蓉，李娜，劉毅，等.中草藥防治奶牛乳腺炎的研究綜述[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2005（04）：2-4.

[責(zé)任編輯：曹明明]

1.2.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

抑菌圈直徑Ф≥16mm為極度敏感；16mm≥Ф≥10mm為高度敏感；10mm≥Ф≥7mm小于為低敏感；7mm≥Ф為不敏感；無抑菌圈為耐藥[8]。

1.2.5 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）測定

從體外抑菌試驗(yàn)中選出11味對3種致病菌高度敏感的中藥采用試管法測定其MIC和MBC[4]。每種藥液用10支試管。試管中注入普通營養(yǎng)肉湯（用于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）或血清營養(yǎng)肉湯（用于鏈球菌）lmL。將lmL滅菌藥液注入第l支試管，用移液槍吹打3下，混勻后吸取1ml注入第2支試管，倍比稀釋，依此類推，到第9管時(shí)吸出1mL棄掉，第10管不加藥液只加1mL純培養(yǎng)基。隨后分別在這10個(gè)試管中注入0.1mL菌液（含菌量為107/mL），吹打混和均勻。置37℃培養(yǎng)24h后觀察混濁度。從試管外觀察，透明、無混濁為此藥最小抑菌濃度（MIC）。從其中吸取10μL培養(yǎng)物接種于小牛血清瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)36h計(jì)數(shù)菌落數(shù)。3個(gè)視野無菌落為無菌生長。此管中藥物的濃度為此藥的最小殺菌濃度。

2 結(jié)果

2.1 20味中藥體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

從表1看出：川紅花、金銀花、白術(shù)、黃芩、茯苓、當(dāng)歸、川芎對3種病原菌都有不同程度的抑菌作用；熟地、大青葉、白芍、地榆僅對金葡菌和鏈球菌有抑菌作用；枳殼僅對金葡菌和大腸桿菌有抑菌作用，對鏈球菌無抑菌作用。

2.2 11味中藥的MIC和MBC的測定結(jié)果

11種中藥的MIC和MBC的測定結(jié)果見表2。

由表2可以看出，當(dāng)歸、川芎、蒲公英、川紅花、白術(shù)、金銀花對3種病原菌都有明顯的殺滅效果。熟地、大青葉、白芍對金葡菌和鏈球菌有明顯的殺滅效果。魚腥草、枳殼對金葡菌和大腸桿菌有明顯的殺滅效果作用。

3 討論

從以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，能夠抑制奶牛乳腺炎3種主要病原菌的中草藥有很多，其中，當(dāng)歸、川芎、蒲公英、川紅花、白術(shù)、金銀花等有效殺滅引起奶牛乳腺炎的病原菌。說明應(yīng)用中草藥治療奶牛乳腺炎有著很好的應(yīng)用前景，而且為有效的中藥復(fù)方制劑研究奠定基礎(chǔ)[9]。

根據(jù)有關(guān)報(bào)道中草藥能夠有效抑制細(xì)菌的生長，其抗菌作用比抗生素強(qiáng)l000倍。但由于所使用的中草藥品質(zhì)相差懸殊及復(fù)合方劑進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)難以達(dá)到高效的體內(nèi)抑菌濃度，使中草藥的治療效果欠佳。其中也與中草藥抗菌的有效活性成分在體內(nèi)和體外的環(huán)境不同引起藥物抗菌能力下降有關(guān)，這也與動(dòng)物體內(nèi)消化液、酶、激素等化學(xué)成分對其影響較大有關(guān)，從而使很大部分中藥沒有達(dá)到與抗生素一樣的效果。另外，中藥不僅具有抗菌作用，還有抗炎作用和調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫的作用，因此，在選擇防治奶牛乳腺炎的中草藥時(shí)，不僅要進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)篩選，還要將挑選出來的中草藥進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)抑菌試驗(yàn)以確保藥物的安全、有效。

【參考文獻(xiàn)】

[1]魏彥.淺談中藥湯劑制法[J].中藥研究與信息，2002，4（7）：52-3.

[2]白峰，王文魁，王廣彬，等.22味中草藥對3種奶牛乳腺炎病原菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2009（05）：5-7.

[3]馬保臣，李建基，劉翠艷.17種中藥對奶牛乳腺炎4種病原菌的抑菌試驗(yàn)[J].中國獸醫(yī)雜志，2003（07）：28-9.

[4]丁月云，李茜，王恬.21種中藥對奶牛乳房炎3種病原菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].畜牧與獸醫(yī)，2004，（12）：5-7.

[5]王廣彬，劉耀偉，白峰，等.桉葉、艾葉對奶牛乳房炎主要病原菌的體外抑菌效果[J].廣西畜牧獸醫(yī)，2008（05）：296-7.

[6]李亞林，段曉琴，簡子健，等.中草藥對奶牛臨床型乳腺炎病原菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].畜禽業(yè)，2008（02）：58-60.

[7]徐叔云，卞如濂，陳修.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].2002.

[8]郁建生，周芳英.20種中草藥制劑抑菌試驗(yàn)初報(bào)[J].中獸醫(yī)學(xué)雜志，1995（1）：2-4.

[9]易湘蓉，李娜，劉毅，等.中草藥防治奶牛乳腺炎的研究綜述[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2005（04）：2-4.

[責(zé)任編輯：曹明明]

1.2.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

抑菌圈直徑Ф≥16mm為極度敏感；16mm≥Ф≥10mm為高度敏感；10mm≥Ф≥7mm小于為低敏感；7mm≥Ф為不敏感；無抑菌圈為耐藥[8]。

1.2.5 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）測定

從體外抑菌試驗(yàn)中選出11味對3種致病菌高度敏感的中藥采用試管法測定其MIC和MBC[4]。每種藥液用10支試管。試管中注入普通營養(yǎng)肉湯（用于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）或血清營養(yǎng)肉湯（用于鏈球菌）lmL。將lmL滅菌藥液注入第l支試管，用移液槍吹打3下，混勻后吸取1ml注入第2支試管，倍比稀釋，依此類推，到第9管時(shí)吸出1mL棄掉，第10管不加藥液只加1mL純培養(yǎng)基。隨后分別在這10個(gè)試管中注入0.1mL菌液（含菌量為107/mL），吹打混和均勻。置37℃培養(yǎng)24h后觀察混濁度。從試管外觀察，透明、無混濁為此藥最小抑菌濃度（MIC）。從其中吸取10μL培養(yǎng)物接種于小牛血清瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)36h計(jì)數(shù)菌落數(shù)。3個(gè)視野無菌落為無菌生長。此管中藥物的濃度為此藥的最小殺菌濃度。

2 結(jié)果

2.1 20味中藥體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

從表1看出：川紅花、金銀花、白術(shù)、黃芩、茯苓、當(dāng)歸、川芎對3種病原菌都有不同程度的抑菌作用；熟地、大青葉、白芍、地榆僅對金葡菌和鏈球菌有抑菌作用；枳殼僅對金葡菌和大腸桿菌有抑菌作用，對鏈球菌無抑菌作用。

2.2 11味中藥的MIC和MBC的測定結(jié)果

11種中藥的MIC和MBC的測定結(jié)果見表2。

由表2可以看出，當(dāng)歸、川芎、蒲公英、川紅花、白術(shù)、金銀花對3種病原菌都有明顯的殺滅效果。熟地、大青葉、白芍對金葡菌和鏈球菌有明顯的殺滅效果。魚腥草、枳殼對金葡菌和大腸桿菌有明顯的殺滅效果作用。

3 討論

從以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，能夠抑制奶牛乳腺炎3種主要病原菌的中草藥有很多，其中，當(dāng)歸、川芎、蒲公英、川紅花、白術(shù)、金銀花等有效殺滅引起奶牛乳腺炎的病原菌。說明應(yīng)用中草藥治療奶牛乳腺炎有著很好的應(yīng)用前景，而且為有效的中藥復(fù)方制劑研究奠定基礎(chǔ)[9]。

根據(jù)有關(guān)報(bào)道中草藥能夠有效抑制細(xì)菌的生長，其抗菌作用比抗生素強(qiáng)l000倍。但由于所使用的中草藥品質(zhì)相差懸殊及復(fù)合方劑進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)難以達(dá)到高效的體內(nèi)抑菌濃度，使中草藥的治療效果欠佳。其中也與中草藥抗菌的有效活性成分在體內(nèi)和體外的環(huán)境不同引起藥物抗菌能力下降有關(guān)，這也與動(dòng)物體內(nèi)消化液、酶、激素等化學(xué)成分對其影響較大有關(guān)，從而使很大部分中藥沒有達(dá)到與抗生素一樣的效果。另外，中藥不僅具有抗菌作用，還有抗炎作用和調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫的作用，因此，在選擇防治奶牛乳腺炎的中草藥時(shí)，不僅要進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)篩選，還要將挑選出來的中草藥進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)抑菌試驗(yàn)以確保藥物的安全、有效。

【參考文獻(xiàn)】

[1]魏彥.淺談中藥湯劑制法[J].中藥研究與信息，2002，4（7）：52-3.

[2]白峰，王文魁，王廣彬，等.22味中草藥對3種奶牛乳腺炎病原菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2009（05）：5-7.

[3]馬保臣，李建基，劉翠艷.17種中藥對奶牛乳腺炎4種病原菌的抑菌試驗(yàn)[J].中國獸醫(yī)雜志，2003（07）：28-9.

[4]丁月云，李茜，王恬.21種中藥對奶牛乳房炎3種病原菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].畜牧與獸醫(yī)，2004，（12）：5-7.

[5]王廣彬，劉耀偉，白峰，等.桉葉、艾葉對奶牛乳房炎主要病原菌的體外抑菌效果[J].廣西畜牧獸醫(yī)，2008（05）：296-7.

[6]李亞林，段曉琴，簡子健，等.中草藥對奶牛臨床型乳腺炎病原菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].畜禽業(yè)，2008（02）：58-60.

[7]徐叔云，卞如濂，陳修.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].2002.

[8]郁建生，周芳英.20種中草藥制劑抑菌試驗(yàn)初報(bào)[J].中獸醫(yī)學(xué)雜志，1995（1）：2-4.

[9]易湘蓉，李娜，劉毅，等.中草藥防治奶牛乳腺炎的研究綜述[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2005（04）：2-4.

[責(zé)任編輯：曹明明]