陳韶萍， 黃 振， 郭瓊霞*， 劉長明

1福建出入境檢驗(yàn)檢疫局,福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350001 2福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002

實(shí)蠅類害蟲隸屬雙翅目Diptera實(shí)蠅科Tephritidae，約有500屬4500種，除了南極與北極這2個高緯度區(qū)域，實(shí)蠅在全世界的熱帶、亞熱帶以及溫帶地區(qū)均有分布(梁廣勤等，2008；王振華等，2009)。世界上具有重要經(jīng)濟(jì)意義的實(shí)蠅主要分為5個類群，即按實(shí)蠅屬Anastrepha、果實(shí)蠅屬Bactrocera、寡鬃實(shí)蠅屬Dacus、臘實(shí)蠅屬Ceratitis以及繞實(shí)蠅屬Rhagoletis(黃振和黃可輝，2012; 梁廣勤等，2008)。我國有實(shí)蠅400余種，絕大多數(shù)種類為水果、蔬菜和花卉作物的害蟲，約有15屬22亞屬150余種，其中70余種被認(rèn)為是具有危險性或潛在危險性的重要害蟲(黃振，2010)；同時其危害的寄主范圍廣，在進(jìn)境口岸經(jīng)常被截獲(黃振等，2012、2014)。

長期以來，實(shí)蠅類害蟲的口岸檢疫鑒定主要以完整的成蟲外部形態(tài)特征為依據(jù)。然而，在口岸中經(jīng)常截獲的大多是實(shí)蠅幼蟲，在這種情況下，通常是將幼蟲在室內(nèi)飼養(yǎng)為成蟲再進(jìn)行鑒定，因其需要花費(fèi)較長的時間，從而影響果蔬進(jìn)出口貿(mào)易的通關(guān)速度。近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，越來越多的分子生物學(xué)技術(shù)被用于昆蟲分類鑒定，如同工酶技術(shù)、DNA條形碼技術(shù)、PCR技術(shù)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD)、限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(RFLP)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性技術(shù)(AFLP)、基因芯片技術(shù)等。這給實(shí)蠅分類鑒定帶來了契機(jī)，即在傳統(tǒng)分類的基礎(chǔ)上借助分子手段，可以更好地解決實(shí)蠅物種鑒定問題。本文主要對目前已經(jīng)被用于實(shí)蠅鑒定的分子生物學(xué)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及其國內(nèi)外研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為今后選用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定實(shí)蠅種屬提供參考。

1 DNA條形碼技術(shù)

1. 1 原理及特點(diǎn)

2003年，加拿大動物學(xué)家Paul Hebert博士提出了DNA條形碼(DNA barcoding)的概念。DNA條形碼技術(shù)的原理類似于商品條形碼，關(guān)鍵是對物種的某一段標(biāo)準(zhǔn)目的基因片段進(jìn)行大范圍比對分析，進(jìn)而識別、鑒定未知的物種或者發(fā)現(xiàn)新種及隱存種等(Hebertetal.，2003)。近年來，由于DNA條形碼技術(shù)操作快速簡便、結(jié)果準(zhǔn)確性高以及可進(jìn)行非專家物種鑒定等特點(diǎn)，為生物分類學(xué)提供了信息化的分類標(biāo)準(zhǔn)和有效的分類手段，成為目前發(fā)展速度最快的前沿學(xué)科之一。

目前，被選作標(biāo)記的分子基因很多，但僅COⅠ (cytochrome oxidase Ⅰ或coxⅠ) 基因被選為DNA條形碼的靶標(biāo)基因。COⅠ基因是位于線粒體呼吸鏈上的編碼細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ的基因，該基因具有幾個特點(diǎn)(Lin & Danforth,2004)：(1)大部分為母系遺傳，相對保守且沒有內(nèi)含子，不包含重復(fù)序列；(2)與其他基因相比，進(jìn)化速率較快；(3)AT含量較高，且在細(xì)胞內(nèi)為多拷貝，比較容易被擴(kuò)增。此外，COⅠ基因有足夠的變異能夠?qū)⒉煌锓N區(qū)分開。

1. 2 國內(nèi)外研究進(jìn)展

李志紅等(2011)利用DNA條形碼技術(shù)成功鑒定了采自泰國四色菊市番石榴爛果中的番石榴實(shí)蠅Bactroceracorrecta(Bezzi)幼蟲。Abd-El-Samie & El Fiky (2011)基于COⅠ序列，分析闡述了在埃及各地區(qū)建立種群的桃實(shí)蠅Bactrocerazonata(Saunders)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。姜帆等(2011)利用DNA條形碼技術(shù)和BOLD系統(tǒng)，對廣西南寧地區(qū)苦瓜中的實(shí)蠅幼蟲樣品進(jìn)行了序列測定、比對和分析。Liangetal.(2011)利用試驗(yàn)獲得的25種實(shí)蠅的155條COⅠ序列，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹與遺傳距離分析，證實(shí)了COⅠ條形碼序列能準(zhǔn)確鑒定、識別除橘小實(shí)蠅Bactroceradorsails(Hendel)復(fù)合種外的中國果實(shí)蠅種屬。Liuetal.(2011)基于形態(tài)學(xué)及COⅠ條形碼序列，成功鑒定了來自布隆迪的入侵果實(shí)蠅BactrocerainvadensDrew。劉慎思等(2012)利用DNA條形碼技術(shù)構(gòu)建實(shí)蠅類害蟲快速鑒定技術(shù)體系，并證實(shí)該物種識別技術(shù)可用于口岸截獲的實(shí)蠅類害蟲幼體及殘體的準(zhǔn)確鑒定。Jiangetal.(2013)利用DNA條形碼技術(shù)，基于SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)了能夠準(zhǔn)確鑒定、識別番石榴實(shí)蠅的特異性引物。

1. 3 實(shí)蠅DNA條形碼的應(yīng)用情況

根據(jù)BOLD Systems現(xiàn)有的數(shù)據(jù)，總結(jié)了截至2014年10月22日實(shí)蠅DNA條形碼的種類、已公布的記錄數(shù)及其涉及的實(shí)蠅種類(表1)。由表1可以看出，實(shí)蠅DNA條形碼的種類主要有COⅠ-5P、COⅠ-3P、COⅡ、COⅢ、CYTB、atp6、28S等7種。其中以COⅠ標(biāo)記為主，已公布的記錄數(shù)為4540，是其他5種DNA標(biāo)記的113. 5倍，其中又以COⅠ-5P標(biāo)記為主，研究的實(shí)蠅種類達(dá)315種，COⅠ-3P標(biāo)記的有116種；果實(shí)蠅屬被研究公布的記錄數(shù)最多，其次為臘實(shí)蠅屬和寡鬃實(shí)蠅屬；BOLD Systems數(shù)據(jù)庫目前以COⅠ-5P標(biāo)記的果實(shí)蠅屬種類達(dá)61種，寡鬃實(shí)蠅屬達(dá)70種，臘實(shí)蠅屬55種，按實(shí)蠅屬11種，繞實(shí)蠅屬12種。

2 以PCR(polymerase chain reaction)為基礎(chǔ)特異性擴(kuò)增快速鑒定技術(shù)

2. 1 常規(guī)PCR技術(shù)

2. 1. 1 原理及特點(diǎn) PCR，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年建立，是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的技術(shù)，其反應(yīng)體系主要包括DNA靶序列、引物、4種dNTP、DNA聚合酶以及適合的緩沖液體系，由高溫變性、低溫退火、適溫延伸3步為一個周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA序列得以擴(kuò)增(王廷華等，2005)。該技術(shù)操作快速簡便、特異性強(qiáng)及靈敏度高，但是具有易被污染、易出現(xiàn)假陽性和假陰性等缺點(diǎn)。

2. 1. 2 國內(nèi)外研究進(jìn)展 余道堅(jiān)等(2004)利用mtDNA COⅠ部分序列，通過對大量的實(shí)蠅基因序列進(jìn)行分析比較，設(shè)計(jì)出2對特異性引物，應(yīng)用定性PCR技術(shù)成功檢測、鑒定了番石榴實(shí)蠅。崔俊霞等(2006)采用形態(tài)學(xué)觀察與PCR技術(shù)相結(jié)合的方法，成功鑒定了從臺灣水果中截獲的疑似橘小實(shí)蠅的幼蟲和蛹。王振華等(2008)采用PCR方法，利用ITS間斷序列分型引物，根據(jù)擴(kuò)增后片段的不同，區(qū)分橘大實(shí)蠅Bactroceraminax(Enderlein)與橘小實(shí)蠅?？浊锷彽?2010)利用特異的嵌套式引物對橘小實(shí)蠅18S rDNA基因片段進(jìn)行擴(kuò)增和序列比對分析，成功鑒定了柑橘果實(shí)中橘小實(shí)蠅的卵。

表1 實(shí)蠅DNA條形碼的應(yīng)用情況Table 1 The application of DNA barcoding for fruit fly identification

2. 2 Real-time PCR技術(shù)

2. 2. 1 原理及特點(diǎn) Real-time PCR，即實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。所謂實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，即指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法(歐陽松應(yīng)等，2004)。與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、能有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn)。目前該技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用。

2. 2. 2 國內(nèi)外研究進(jìn)展 余道堅(jiān)等(2006)基于mtDNA COⅠ設(shè)計(jì)引物，建立了SYBR Green實(shí)時熒光PCR技術(shù)快速鑒定辣椒實(shí)蠅Bactroceralatifrons(Hendel)的方法。Fengetal.(2007)基于mtDNA COⅠ，應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)成功鑒定了三葉斑潛蠅Liriomyzatrifolii(Burgess)幼蟲。徐浪等(2010)基于mtDNA COⅠ設(shè)計(jì)6條特異性引物，應(yīng)用AllGlo實(shí)時熒光PCR方法成功鑒定了南美按實(shí)蠅Anastrephafraterculus(Wiedemann)、墨西哥按實(shí)蠅Anastrephaludens(Loew)、西印度按實(shí)蠅Anastrephaoblique(Macquart)、印加按實(shí)蠅AnastrephadistinctaGreene、中美按實(shí)蠅AnastrephastriataSchiner等6種重要的按實(shí)蠅。

2. 3 RFLP(restriction fragment length polymorphism)技術(shù)

2. 3. 1 原理及特點(diǎn) RFLP，即限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)，于1980年由Bostein建立并發(fā)展起來。它是指利用限制性內(nèi)切酶酶解樣品DNA從而產(chǎn)生不同長度的DNA片，進(jìn)而通過電泳將不同長度的DNA片段分離出來(周延清，2005)。該技術(shù)具有多態(tài)性豐富、對基因組的覆蓋范圍比較廣等優(yōu)點(diǎn)，但存在成本昂貴、操作繁瑣、檢測周期長等缺點(diǎn)。

2. 3. 2 國內(nèi)外研究進(jìn)展 Muraji & Nakahara (2002)應(yīng)用RFLP技術(shù)研究了亞太地區(qū)18種實(shí)蠅的快速鑒定方法，結(jié)果表明，除了楊桃實(shí)蠅BactroceracarambolaeDrew & Hancock和木瓜實(shí)蠅BactrocerapapayaeDrew & Hancock，該方法可準(zhǔn)確鑒別其他16種實(shí)蠅害蟲。吳佳教等(2004)研究表明，RFLP技術(shù)適用于橘小實(shí)蠅、銹實(shí)蠅Bactrocerarubigina(Wang & Zhao)、瓜實(shí)蠅Bactroceracucurbitae(Coquillett)、南瓜實(shí)蠅Bactroceratau(Walker)、具條實(shí)蠅Bactrocerascutellata(Hendel)及木姜子實(shí)蠅BactrocerahyalineShiraki等6種實(shí)蠅的快速鑒定。吳佳教等(2005)應(yīng)用RFLP技術(shù)，對我國口岸截獲頻率較高的9種檢疫性實(shí)蠅進(jìn)行了快速鑒定。林麗莉等(2007)應(yīng)用RFLP技術(shù)，對我國部分地區(qū)發(fā)生分布的蜜柑大實(shí)蠅Bactroceratsuneonis(Miyake)和橘大實(shí)蠅開展了分子生物學(xué)鑒定方法的研究并取得成功。Chuaetal.(2010)采用RFLP技術(shù)成功區(qū)分了楊桃實(shí)蠅和木瓜實(shí)蠅，進(jìn)而使橘小實(shí)蠅復(fù)合種的有效識別得以實(shí)現(xiàn)。

2. 4 RAPD(randomly amplified polymorphic DNA)技術(shù)

2. 4. 1 原理及特點(diǎn) RAPD，即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)，由美國杜邦公司和加利福尼亞生物研究所在1900年提出(Welsh & McClelland，1990；Williamsetal.，1990)。它以一種或多種隨機(jī)引物對模板DNA進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，是建立在PCR基礎(chǔ)上研究模板DNA多態(tài)性的遺傳標(biāo)記技術(shù)。其基本原理是利用人工合成的短核苷酸(大約10個堿基)對DNA靶序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離及溴化乙錠染色就可檢測出DNA靶序列的多態(tài)性(溫孚江，2002)。該技術(shù)具有操作簡便易行、分析快捷方便、不用專門設(shè)計(jì)引物及引物數(shù)量不限等優(yōu)點(diǎn)，但是存在穩(wěn)定性差、重復(fù)性差、易出現(xiàn)假帶等缺點(diǎn)。

2. 4. 2 國內(nèi)外研究進(jìn)展 Haymer & McInnis (1994)應(yīng)用RAPD技術(shù)鑒定了地中海實(shí)蠅Ceratitiscapitata(Wiedemann)，認(rèn)為RAPD技術(shù)可用于證明害蟲同一種群和不同種群間的遺傳變異。張紅梅等(2004)利用RAPD技術(shù)對陜西省常見4種實(shí)蠅基因組DNA的多態(tài)性進(jìn)行了初步研究。張亮和張智英(2007)采用RAPD技術(shù)鑒定了南瓜實(shí)蠅、黑漆實(shí)蠅Bactrocerascutellaris(Bezzi)、具條實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅、橘小實(shí)蠅和番石榴實(shí)蠅等6種實(shí)蠅。

2. 5 AFLP(amplified fragment length polymorphism)技術(shù)

2. 5. 1 原理及特點(diǎn) AFLP，即擴(kuò)增片段長度多態(tài)性技術(shù)，是一種基于PCR技術(shù)的選擇性擴(kuò)增限制性片段的方法，基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后在限制性片段兩端連接人工接頭作為擴(kuò)增的模板，接頭序列和相鄰的限制性位點(diǎn)序列作為引物結(jié)合位點(diǎn)(鞠秀芝等，2005)。該技術(shù)具有快速高效、多態(tài)性豐富、可靠性好等優(yōu)點(diǎn)，但同時存在分析成本高、對樣本DNA質(zhì)量要求較高等缺點(diǎn)。

2. 5. 2 國內(nèi)外研究進(jìn)展 Kakouli-Duarteetal.(2001)采用AFLP技術(shù)準(zhǔn)確區(qū)分了地中海實(shí)蠅和納塔爾小條實(shí)蠅CeratitisrosaKarsch。我國暫無相關(guān)報道。

2. 6 基因芯片技術(shù)

2. 6. 1 原理及特點(diǎn) 基因芯片是生物芯片的一種，又被稱作DNA芯片。其工作原理：經(jīng)過標(biāo)記的待測樣本DNA與位于芯片上特定位置的探針雜交，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原則確定靶DNA序列，最后經(jīng)激光共聚集顯微鏡掃描，利用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對熒光信號進(jìn)行比較和檢測進(jìn)而迅速得出所需信息(馮永強(qiáng)和閻小君，2000)。該技術(shù)具有快速高效、高通量、微型化以及自動化等優(yōu)點(diǎn)，但同時存在技術(shù)復(fù)雜、成本昂貴、檢測靈敏度低、重復(fù)性差及分析范圍較窄等缺點(diǎn)。

2. 6. 2 國內(nèi)外研究進(jìn)展 李文芬等(2008)選擇mtDNA COⅠ作為分子標(biāo)記基因，建立了地中海實(shí)蠅、芒果小條實(shí)蠅Ceratitiscosyra(Walker)以及納塔爾小條實(shí)蠅等實(shí)蠅科重要害蟲的生物芯片檢測方法。國外暫未發(fā)現(xiàn)相關(guān)文獻(xiàn)。

3 問題與展望

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，其在昆蟲分類中的應(yīng)用也越來越廣，這些技術(shù)不僅驗(yàn)證了傳統(tǒng)分類所得出的結(jié)論，而且解決了傳統(tǒng)分類所無法解決的疑難問題，均顯示出分子生物學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢及廣闊的發(fā)展前景。

雖然分子生物學(xué)技術(shù)具有準(zhǔn)確、客觀等特點(diǎn)，即分子序列的信息代表遺傳的本質(zhì)，它不受物種個體發(fā)育階段及環(huán)境條件等的影響，但同時存在許多問題。首先，從龐大的DNA文庫中選擇最佳、最能反映物種間進(jìn)化關(guān)系的基因片段仍存在較大難度；其次，選擇不同的目的基因研究同一物種，可能會得到不同的結(jié)果；再次，使用不同的分子生物學(xué)分析軟件有可能得出不同的結(jié)果。這些問題是今后昆蟲分類研究的重要課題。

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