張文靜， 崔麗艷， 張 捷

(北京大學(xué)第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100191)

“自噬”(autophagy)是廣泛存在于真核細(xì)胞生物中的一種細(xì)胞自我吞噬的現(xiàn)象，在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞自噬維持在很低的基線水平，用以清除衰老的細(xì)胞器及降解異常積聚的蛋白質(zhì)，從而保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。當(dāng)細(xì)胞處于饑餓、生長(zhǎng)因子缺乏或高能量需求狀態(tài)時(shí)，自噬水平迅速上調(diào)。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)自噬參與多種疾病的發(fā)生過(guò)程，如感染、腫瘤、神經(jīng)元退變性疾病和心臟疾病等［1］。其中心、腦、腎等疾病的發(fā)生均與缺血再灌注損傷密切相關(guān)。研究表明自噬在缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，因此，自噬也與這些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而，在缺血再灌注損傷發(fā)生的過(guò)程中自噬究竟是發(fā)揮保護(hù)性作用還是進(jìn)一步加重?fù)p害目前仍無(wú)定論，本研究將就自噬及其在缺血再灌注損傷中的作用進(jìn)行綜述。

一、自噬及其生理意義

真核細(xì)胞可以通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬這兩種方式來(lái)降解蛋白質(zhì)，其中自噬主要負(fù)責(zé)降解長(zhǎng)壽命蛋白和一些細(xì)胞器。自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，當(dāng)自噬被誘導(dǎo)后，首先在細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)單層膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而單層膜凹陷形成雙層膜樣的分隔膜，完全包裹胞內(nèi)待降解物成為自噬體，最終被運(yùn)送至溶酶體并被溶酶體降解［2］。根據(jù)底物進(jìn)入溶酶體途徑的不同，自噬可分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬這3種類型，它們?cè)诜肿訖C(jī)制和功能方面截然不同［3］，其中，人們對(duì)巨自噬的研究最為廣泛而深入，通常所說(shuō)的“細(xì)胞自噬”主要是指巨自噬。

當(dāng)細(xì)胞處于營(yíng)養(yǎng)缺乏的狀態(tài)時(shí)，清除胞內(nèi)耗能且無(wú)用的蛋白質(zhì)及細(xì)胞器變得十分必要，此時(shí)通過(guò)自噬可以將其降解并產(chǎn)生能量供細(xì)胞利用。因此，自噬一直被認(rèn)為是細(xì)胞的一種保護(hù)性作用，在維持缺血缺氧等應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞存活、清除細(xì)胞內(nèi)衰老細(xì)胞器及錯(cuò)誤折疊蛋白中起重要作用［4］。然而，過(guò)度的自噬不但不能起到保護(hù)細(xì)胞的作用，反而會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的死亡，這樣的死亡細(xì)胞不具備凋亡的典型特點(diǎn)，如核固縮、核破裂、細(xì)胞皺縮，沒(méi)有凋亡小體的形成，也不具備細(xì)胞壞死的特點(diǎn)，是不同于調(diào)亡和壞死的一種新的細(xì)胞程序性死亡，被稱為自噬性細(xì)胞死亡或Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡［5］。

二、自噬的誘導(dǎo)和分子調(diào)控

自噬作為一種重要的物質(zhì)代謝方式，其發(fā)生發(fā)展受到嚴(yán)格的調(diào)節(jié)和控制，通常是由自噬相關(guān)基因(Atg)來(lái)調(diào)節(jié)的。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在酵母菌及其他真菌體內(nèi)至少存在32種Atg［6］，其中大部分的Atg基因在高等真核細(xì)胞生物中也是保守存在的并發(fā)揮相似的功能。

自噬的發(fā)生過(guò)程可以被劃分成4個(gè)獨(dú)立卻又連續(xù)的步驟:(1)接受自噬誘導(dǎo)物的刺激并誘導(dǎo)自噬;(2)自噬體的形成;(3)自噬體與溶酶體膜的融合;(4)自噬體的降解［7］。參與自噬的有3個(gè)關(guān)鍵的蛋白復(fù)合物，包括Atg1復(fù)合物、雷帕霉素作用靶點(diǎn)復(fù)合物1(TORC1)和Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶復(fù)合物(PI3K)［6］。在自噬過(guò)程中，他們發(fā)揮各自不同的作用。

當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞外的(如外界中的營(yíng)養(yǎng)成分、缺血缺氧、生長(zhǎng)因子的濃度等)和細(xì)胞內(nèi)的(如代謝壓力、衰老或破損的細(xì)胞器、折疊錯(cuò)誤或聚集的蛋白質(zhì)等)刺激后，TORC1作為饑餓感受器，可感受細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)［8］，并激活A(yù)MP-活化蛋白激酶(AMPK)，使mTOR磷酸化并使其活性下降［9］。實(shí)驗(yàn)證明，營(yíng)養(yǎng)缺乏或直接使用雷帕霉素抑制mTOR活性，很可能同時(shí)激活某種磷酸酶，導(dǎo)致Atg13部分脫磷酸化，使之與Atg1緊密結(jié)合［10］，這種結(jié)合可以使Atg1活化，為自噬體的形成奠定基礎(chǔ)［7］。除此之外，自噬體的聚集和形成還需要一個(gè)關(guān)鍵的復(fù)合物，就是Ⅲ型PI3K復(fù)合物，其中包括哺乳動(dòng)物自噬相關(guān)蛋白Beclin1，能夠招募其他的結(jié)構(gòu)蛋白到自噬體的膜上［11］，有助于自噬體的形成。與此作用相反的是，I型PI3K卻可以通過(guò)Akt抑制自噬的發(fā)生［12］。

三、自噬在缺血再灌注損傷中的作用

缺血所引起的組織損傷是致死性疾病的主要原因，如心肌梗死、腦卒中、肝腎缺血等。大量研究發(fā)現(xiàn)對(duì)組織造成損傷的主要因素，不是缺血本身，而是恢復(fù)血液供應(yīng)后，過(guò)量的自由基攻擊這部分重新獲得血液供應(yīng)的組織內(nèi)的細(xì)胞造成的，被稱為“缺血再灌注損傷”。

目前，大量的科學(xué)研究表明，當(dāng)器官發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，機(jī)體會(huì)上調(diào)自噬水平。通過(guò)電鏡觀察自噬體形成，或者通過(guò)檢測(cè)Atg的mRNA和蛋白水平等方法均可證實(shí)這一結(jié)論。對(duì)大鼠心臟進(jìn)行缺血處理后，能觀察到心肌細(xì)胞內(nèi)自噬體明顯增加［13］，在缺血再灌注的胎鼠心肌細(xì)胞內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了自噬增強(qiáng)的證據(jù)［14］。同時(shí)，Rami等［15］發(fā)現(xiàn)在腦缺血灶中細(xì)胞死亡的同時(shí)伴有Beclin1表達(dá)的升高，說(shuō)明細(xì)胞死亡同時(shí)伴隨自噬的發(fā)生。Suzuki等［16］在腎臟發(fā)生缺血再灌注損傷的小鼠模型和人的移植腎活組織標(biāo)本中均發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞中自噬體增多的現(xiàn)象，說(shuō)明在腎臟發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)自噬水平也是上調(diào)的。因此，在發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)自噬增強(qiáng)是毋庸置疑的。但是，研究結(jié)果顯示，雖然自噬在心肌缺血中起保護(hù)性作用，但在再灌注階段對(duì)心肌有害［17］?？梢?jiàn)，在缺血階段和再灌注階段自噬發(fā)揮的作用是不同的，其分子機(jī)制也有所不同，以下將分別進(jìn)行闡述。

1.自噬在器官缺血缺氧時(shí)發(fā)揮的作用及其相關(guān)分子機(jī)制 近年來(lái)，大量利用缺血缺氧動(dòng)物模型和細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了自噬不僅對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)下的細(xì)胞起保護(hù)作用，而且能促進(jìn)細(xì)胞存活。Kim等［18］觀察到處于冬眠狀態(tài)的心肌細(xì)胞內(nèi)自噬體明顯增加，自噬相關(guān)蛋白Beclin1水平上調(diào)，同時(shí)心肌細(xì)胞的調(diào)亡水平下降，心肌梗死面積減小，說(shuō)明自噬的增強(qiáng)對(duì)缺血的心肌細(xì)胞起到了保護(hù)性作用。正常的新生鼠在出生后短期內(nèi)能通過(guò)提高自噬來(lái)維持存活，而敲除了自噬相關(guān)基因Atg5或Atg7的新生鼠出生后很快死亡［14］。該現(xiàn)象進(jìn)一步證實(shí)了自噬在器官缺血階段對(duì)細(xì)胞的保護(hù)性作用。

在器官缺血缺氧階段，細(xì)胞內(nèi)的ATP水平明顯下降，導(dǎo)致 AMP/ATP比例增高，此時(shí)，AMPK作為感受器能接受能量減少的信號(hào)而被激活，AMPK的激活不僅通過(guò)磷酸化TSC2而抑制了mTOR的活性，而且促進(jìn)了eEF2的磷酸化。該過(guò)程能夠抑制蛋白質(zhì)合成，誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生，幫助機(jī)體適應(yīng)缺氧環(huán)境［19］。Matsui等［17］通過(guò)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠心肌缺血再灌注模型，對(duì)心肌細(xì)胞使用AMPK的抑制劑后，觀察到心肌細(xì)胞內(nèi)微管相關(guān)蛋白輕鏈3的Ⅱ型與Ⅰ型之比(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)的比值減小，自噬作用被抑制，細(xì)胞死亡數(shù)目增加，證實(shí)了AMPK-mTOR途徑是心肌缺血時(shí)自噬產(chǎn)生的主要信號(hào)通路。

除了mTOR途徑以外，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2在細(xì)胞缺血缺氧時(shí)被磷酸化，從而失去與Beclin1的結(jié)合作用，同樣可以誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生。因此，抑制Bcl-2蛋白能抑制Beclin1依賴性自噬，可能是缺血缺氧狀態(tài)下主要的非mTOR的自噬調(diào)節(jié)途徑［20］。另有報(bào)道，缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)在細(xì)胞缺血缺氧時(shí)可以通過(guò)上調(diào)表達(dá)水平來(lái)促進(jìn)自噬的產(chǎn)生［21］。以上研究結(jié)果顯示，在細(xì)胞缺血缺氧階段，機(jī)體主要通過(guò)mTOR途徑誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生，從而起到保護(hù)細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞存活的作用，其作用機(jī)制有可能是通過(guò)抑制凋亡而促使缺血細(xì)胞存活［22］。有關(guān)這方面機(jī)制的研究仍需進(jìn)一步探討。

2.自噬在器官再灌注階段發(fā)揮的作用及其相關(guān)分子機(jī)制 盡管有人猜測(cè)當(dāng)器官出現(xiàn)再灌注時(shí)，隨著缺血狀態(tài)的緩解，自噬也應(yīng)該逐漸減弱，但事實(shí)證明在再灌注階段自噬是增強(qiáng)的［17］。而過(guò)度的自噬會(huì)導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡，這種自噬性細(xì)胞死亡常常伴隨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的現(xiàn)象，因此有人猜測(cè)自噬過(guò)度時(shí)，有可能會(huì)觸發(fā)細(xì)胞的凋亡程序而引起細(xì)胞死亡［23］，同時(shí)，也有研究認(rèn)為自噬和細(xì)胞凋亡是同時(shí)存在的，并且它們之間存在相互協(xié)作與相互制約的雙重作用［24］。研究結(jié)果顯示，一些被我們所熟知的凋亡誘導(dǎo)物能夠同時(shí)激活自噬［25］，說(shuō)明自噬與凋亡在分子調(diào)控通路上存在相同的調(diào)控物。但是，到目前為止，對(duì)于究竟是自噬誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡還是自噬伴隨細(xì)胞凋亡這一問(wèn)題仍存在爭(zhēng)議。

Gotoh等［26］構(gòu)建了大鼠肝臟的缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)在再灌注階段，自噬增強(qiáng)，肝細(xì)胞大量脫落并阻塞肝血竇，使得肝臟大面積壞死。Suzuki等［16］對(duì)同種異體腎移植的鼠腎進(jìn)行缺血再灌注，并利用自噬抑制劑3-MA抑制自噬，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡的數(shù)量減少。除此之外，通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行Beclin1基因敲除，再進(jìn)行缺血再灌注模型的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)基因敲除后小鼠心肌細(xì)胞的自噬和凋亡水平均下降，心肌梗死面積減?。?7］。Matsui等［17］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明在心肌再灌注階段，細(xì)胞自噬作用的上調(diào)主要靠Beclin1的表達(dá)增強(qiáng)。通過(guò)抑制Beclin1的表達(dá)，可抑制細(xì)胞在再灌注階段的自噬作用，減輕心肌自噬性細(xì)胞死亡程度。說(shuō)明在再灌注階段，過(guò)度的自噬可以加重細(xì)胞損傷并導(dǎo)致細(xì)胞的自噬性死亡，其主要機(jī)制可能與Beclin1與Bcl-2之間的相互作用相關(guān)。近來(lái)也有人發(fā)現(xiàn)活性氧ROS在鼠心臟的缺血/再灌注中對(duì)于上調(diào)Beclin1的表達(dá)及誘導(dǎo)自噬中起關(guān)鍵作用，而這一作用在再灌注階段尤為重要［28］。說(shuō)明在細(xì)胞再灌注階段，機(jī)體主要通過(guò)Beclin1的表達(dá)增強(qiáng)進(jìn)一步加重自噬，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。

綜上所述，自噬是機(jī)體在缺血/再灌注損傷時(shí)的一種生理性反應(yīng)，主要通過(guò)激活A(yù)MPK并抑制mTOR途徑誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生，有可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡對(duì)缺血細(xì)胞起到保護(hù)性作用，然而，在再灌注階段，自噬的產(chǎn)生主要依賴于Beclin1的表達(dá)增強(qiáng)，過(guò)度的自噬在再灌注階段不利于細(xì)胞存活并加重細(xì)胞損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，其作用機(jī)制主要與Beclin1與Bcl-2之間的相互作用相關(guān)。隨著人們對(duì)自噬研究的不斷深入，將來(lái)我們可以通過(guò)對(duì)自噬信號(hào)通路上的信號(hào)分子進(jìn)行人為干預(yù)，從而調(diào)整自噬水平，作為一種治療手段來(lái)盡可能減輕缺血/再灌注損傷用以治療相關(guān)疾病。

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