彭玉嬌，李敬龍，林學(xué)政

(1. 齊魯工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，山東 濟南 250353； 2. 國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061； 3.國家海洋局 海洋生物活性物質(zhì)重點實驗室，山東 青島 266061)

極地抗植物病原真菌活性菌株P(guān)KS和NRPS基因的克隆與分析*1

彭玉嬌1,2,3，李敬龍1，林學(xué)政2,3*

(1. 齊魯工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，山東 濟南 250353； 2. 國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061； 3.國家海洋局 海洋生物活性物質(zhì)重點實驗室，山東 青島 266061)

植物常見病原真菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)為指示菌，采用平板擴散法對實驗室保藏的38株極地細(xì)菌進行了抑菌活性驗證，并對其中活性較強的菌株進行了分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析及次級代謝產(chǎn)物合成功能基因(PKS和NRPS)的克隆與分析。結(jié)果表明，38株極地細(xì)菌中，13株具有明顯的抗病原真菌活性；分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析表明，11株活性菌株屬于Pseudomonas，1株屬于Psychrobacter，1株屬于Arthrobacter；對活性菌株P(guān)KS和NRPS基因的克隆與分析表明，從10株活性菌株克隆到12條NRPS A結(jié)構(gòu)域基因片段，其中5株活性菌株同時含有PKS I型 KS結(jié)構(gòu)域基因片段。據(jù)此為從聚酮和非核糖體肽等生物合成途徑深入研究活性菌株的次級代謝產(chǎn)物提供了基因?qū)W證據(jù)。

極地細(xì)菌；抑菌活性；多聚酮合酶；非核糖體肽合成酶

微生物來源的天然產(chǎn)物一直是發(fā)現(xiàn)新型藥物先導(dǎo)化合物的重要來源。經(jīng)過長期和廣泛深入的研究之后，從陸地微生物中發(fā)現(xiàn)新的天然產(chǎn)物已越來越困難，而蘊涵著極其豐富生物資源的海洋微生物種群則是當(dāng)今天然產(chǎn)物藥物開發(fā)的巨大寶庫。極地自然環(huán)境與地理環(huán)境的特殊性決定了極地微生物具有巨大的研究與開發(fā)潛力。隨著新的病原微生物及其耐藥性的不斷出現(xiàn)，能否快速篩選到具有新結(jié)構(gòu)、新活性的微生物代謝產(chǎn)物已成為新藥研究迫切面對的問題[1]。

海洋微生物的次級代謝產(chǎn)物主要為聚酮類化合物和肽類化合物，負(fù)責(zé)該兩類化合物生物合成的酶分別為聚酮合酶(polyketide synthases，PKS)和非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase，NRPS)[2]。PKS是一類復(fù)雜的多酶體系，多以簡單的脂酰CoA為底物，通過重復(fù)的脫羧縮合過程產(chǎn)生線性聚酮化合物或環(huán)狀的酮內(nèi)酯，其過程類似于脂肪酸合酶催化的脂肪酸生物合成[3]。目前,普遍認(rèn)為PKS分為I型、II型和III型三種類型,其中，尤以PKS I型途徑合成的化合物結(jié)構(gòu)多樣、活性范圍廣著稱[4]。這些聚酮化合物大多具有激素、抗生素、抗真菌素、抗腫瘤等生物活性，在至今上市的醫(yī)藥或農(nóng)用抗生素結(jié)構(gòu)中聚酮類化合物來源的比例居已知六大類天然產(chǎn)物的首位，具有重要的商業(yè)價值。在細(xì)菌和真菌中，一些重要多肽類物質(zhì)的合成可以繞開核糖體，在這一類特殊的多肽化合物合成中起關(guān)鍵作用的一類特殊的酶就是非核糖體肽合成酶(NRPS)[5]。NRPS由多個模塊組成，特定模塊的結(jié)構(gòu)域具有特定的酶活，催化相應(yīng)單體結(jié)合到新生肽鏈中。這些結(jié)構(gòu)域包括腺苷?；Y(jié)構(gòu)域(A結(jié)構(gòu)域)、巰基化結(jié)構(gòu)域(T結(jié)構(gòu)域)、縮合結(jié)構(gòu)域(C結(jié)構(gòu)域)、差向異構(gòu)結(jié)構(gòu)域(E結(jié)構(gòu)域)和甲基化結(jié)構(gòu)域(M結(jié)構(gòu)域)等[6]。據(jù)報道，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的NRPS產(chǎn)物中稀有氨基酸多達(dá)300個，它們主要來源于E結(jié)構(gòu)域的差向異構(gòu)化、M結(jié)構(gòu)域的N-甲基化和其它結(jié)構(gòu)域的?；⑻腔半s環(huán)化修飾[7]，這正是這類代謝產(chǎn)物多樣化的原因。NRPS合成的多肽類化合物具有獨特多樣的生物活性，已被廣泛應(yīng)用和研究。應(yīng)用最多的是多肽類抗生素，如萬古霉素、Daptomycin、桿菌肽等，此外還可以作為免疫抑制劑藥物、生物表面活性劑、抗癌藥物、細(xì)胞生長抑制劑和抗病毒藥物等[8]。

本研究以尖孢鐮刀菌為指示菌對實驗室保藏的38株極地細(xì)菌進行了抑菌活性驗證，對其中具有較強抑菌活性的菌株進行了基于16S rRNA基因的分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析；并對次級代謝產(chǎn)物合成基因PKS、NRPS進行了克隆與分析，以期為從生物合成途徑深入研究其次級代謝產(chǎn)物提供分子生物學(xué)的證據(jù)，并為今后開發(fā)利用極地微生物次級代謝產(chǎn)物的生物合成提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 菌 株

極地抗植物病原真菌活性菌株為國家海洋局海洋生物活性物質(zhì)重點實驗室分離并保存；以植物病原真菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)作為抗植物病原真菌指示菌;感受態(tài)細(xì)胞EscherichiacoliDH5α購于TaKaRa公司。

1.2 培養(yǎng)基與菌株活性驗證

海水Zobell 2216 E培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基配置及菌株的活性驗證(平板擴散法)均參照文獻(xiàn)[9]。

1.3 實驗儀器及試劑

pMD18-T Vector (TaKaRa，D101A)；細(xì)菌基因組提取試劑盒(TIANGEN，DP302-02)、普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN，DP209-02)、2×Taq PCR MasterMix (TIANGEN，KT201)。

1.4 活性菌株基因組DNA的提取

按照細(xì)菌基因組提取試劑盒的操作步驟提取細(xì)菌基因組DNA，將提取的細(xì)菌基因組DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于-20 ℃儲存。

1.5 16S rRNA基因擴增

以27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTAC GACTT-3′)為引物，使用50 μL擴增體系(1 μL 27F，1 μL 1492R，25 μL Master Mix，23 μL ddH2O)，PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，進行16S rRNA基因擴增。

1.6 PKS與NRPS基因擴增簡并引物與基因克隆

以PKS-U(5′-GCGATGGATCCNCAGCAGCG-3′)和PKS-D(5′-GTGCCGGTNCCGTGNGYYTC-3′)為引物[2]，使用50 μL擴增體系，PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，59 ℃ 1 min，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，進行PKS基因擴增。

以NRPS-U (5′-GCSTACSYSA TSTACACSTCSGG-3′)和NRPS-D (5′-SASGTCVCCSGTSCGG TAS-3′) 為引物[2]，使用50 μL擴增體系，PCR反應(yīng)條件為50 μL擴增體系，反應(yīng)條件為 95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，進行NRPS基因擴增。

擴增到的目的基因經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Tiangen，DP209-02) 回收，操作步驟按其說明書進行。

1.7 序列測定及分析

將PCR反應(yīng)得到的目的條帶切膠回收，連接T載體pMD18-T后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH 5α。將經(jīng)T載體特異性引物M13-47/RV-M驗證后的陽性克隆子送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序，將得到的目標(biāo)片段序列采用BALST程序進行同源比對分析并提交GenBank數(shù)據(jù)庫，利用軟件Mega 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性與系統(tǒng)發(fā)育分析

以尖孢鐮刀菌為指示菌，利用平板擴散法對實驗室保藏的38株極地細(xì)菌進行了抗植物病原真菌活性驗證。結(jié)果表明，其中13株菌株具有明顯的抑菌活性，對其進行了16S rRNA基因擴增與分析，將得到的序列提交GenBank，經(jīng)BLAST比對得到最高相似菌株，并利用Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果分別見表1和圖1。

表1 活性菌株分子鑒定及其抑菌效果Table 1 identification of antifungal strains and their antifungal effects

從表1中可以看出，38株極地活性菌株中有13株具有明顯的抑菌活性(抑菌圈直徑均>16 mm)；其中菌株C-1抑菌效果最明顯，抑菌圈直徑達(dá)到26.0 mm。菌株11W、83-1、195、2-Z18、P406、P4-11-07和P499抑菌效果也比較顯著，均在20 mm以上；本研究中活性菌株絕大多數(shù)與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有菌株的16S rRNA 基因序列存在著很高的相似性，相似性均在99%以上，且假單胞菌屬(Pseudomonas)活性菌株的抑菌活性明顯高于嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)的活性菌株；13株活性菌株分別屬于3個屬，其中11株屬于Pseudomonas，1株屬于Psychrobacter，1株屬于Arthrobacter。

圖1 抗菌活性菌株的16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of antimicrobial bacteria based on 16S rRNA gene sequences

注：節(jié)點處的數(shù)字表示在1 000次運算中出現(xiàn)的概率，只表示出了≥50%的情況

2.2 PKS基因的擴增結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育分析

利用簡并引物PKS-U/PKS-D從13株活性菌株中擴增PKS基因，將處理好的測序結(jié)果提交至NCBI并使用BLASTX功能進行基因比對，活性菌株P(guān)KS基因的擴增及分析結(jié)果見表2。由表2可以看出從5株活性菌株(C-1、P499、83-1、P406和205)中成功擴增到PKS基因片段，長度在1 125～1 143 bp之間，其余8株均未成功擴增出PKS片段；從5株活性菌株中擴增到的5條PKS基因片段均與Pseudomonas brassicacearum NFM421的酰基轉(zhuǎn)移酶(PKS)的基因序列相似度最高，相似度在88%左右。將得到的PKS基因的核苷酸序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得序列注冊號為：KF297895～KF297899。

表2 所獲PKS片段與GenBank中氨基酸序列同源性狀況Table 2 PKS gene fragments obtained in present study and their identities in the GenBank

將本研究得到的PKS基因核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，使用Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

通過基于PKS氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析(圖2)，推斷本研究得到的PKS基因片段編碼的蛋白序列都屬于KS結(jié)構(gòu)域的trans-AT型，這種類型的PKS被認(rèn)為與有藥物活性的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生有關(guān)[10]。這與抑菌活性實驗結(jié)果一致，成功擴增出PKS基因片段的菌株C-1、P499、83-1、P406、205在抑菌活性實驗中均表現(xiàn)出較強的抑菌活性。這說明PKS基因可能與具有抗植物病原真菌活性的化合物的合成有關(guān)。

圖2 基于PKS氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis based on amino PKS acid sequences using neighbor-joining method

2.3 NRPS基因的擴增結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育分析

利用NRPS簡并引物從13株活性菌株中擴增NRPS基因，將處理好的測序結(jié)果提交至NCBI并使用BLASTX功能進行基因比對，結(jié)果從10株活性菌株中擴增到NRPS基因的片段,擴增結(jié)果及分析見表3。

表3 所獲NRPS片段與GenBank中氨基酸序列同源性狀況Table 3 NRPS gene fragments obtained in present study and their identities in the GenBank

從表3中可以看出,從10株活性菌株(C-1、83-1、P406、P499、205、195、P4-11-07、LX-4、2-Z18和11W)中成功擴增出了12條NRPS基因片段，長度在684～720 bp之間，與預(yù)期基因片段的長度一致。這說明NRPS基因在Pseudomonas中能廣泛存在。從表中可以看出除菌株P(guān)499和菌株11W的NRPS基因序列與數(shù)據(jù)庫菌株蛋白Amp-binding enzyme(NRPS基因)基因序列的相似度最低，為88%。其他菌株的相似度均在90%以上。12株活性菌株的氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫相似的菌株主要為PseudomonasfluorescensSS101和Pseudomonassp. R81。將得到的NRPS基因的核苷酸序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得序列注冊號為：KF026290～KF026301。

值得指出的是，從菌株C-1和P499均成功擴增出2條NRPS基因片段，分別為NRP17/NRP19和NRP4995/NRP4998。由BLAST結(jié)果可知，片段NRP17與菌株P(guān)seudomonasfluorescensSBW25的NRPS A域相似性最高，為90%；片段NRP19與菌株P(guān)seudomonassp. R81的NRPS A域相似性最高，為94%；片段NRP4995與菌株P(guān)seudomonassp. R81的NRPS A域相似性最高，為94%；片段NRP4998與菌株P(guān)seudomonasfluorescensSBW25的NRPS A域相似性最高，為89%。由BLAST可知，從菌株C-1克隆到的2個NRPS基因片段NRP17和NRP19的氨基酸序列相似度僅為35%;從菌株499克隆到的2個NRPS基因片段NRP4995和NRP4998的氨基酸序列相似度僅為38%。由此得出，從同一菌株中擴增出的2條NRPS片段相似度均較低。

將本研究得到的NRPS基因核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，使用Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖3。

圖3 基于NRPS氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic analysis based on NRPS amino acid sequences using neighbor-joining method

BLAST結(jié)果及NRPS系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)均表明本研究所得NRPS基因片段編碼的蛋白序列為NRPS基因簇的腺苷酰化結(jié)構(gòu)域(adenylation，A)，且供試的11株P(guān)seudomonas菌株除1株未得到NRPS片段外，其余10株均成功擴增到NRPS片段，說明NRPS基因在Pseudomonas中廣泛存在。

3 討 論

本研究以尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)為指示菌，采用平板擴散法對實驗室保藏的38株極地細(xì)菌進行了抑菌活性驗證，并對其中活性較強的菌株進行了基于16S rRNA的分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析以及PKS和NRPS基因的克隆與分析。

活性驗證實驗表明，38株極地細(xì)菌中13株具有較強抗菌活性；分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析表明，11株菌株屬于Pseudomonas，1株屬于Psychrobacter，1株屬于Arthrobacter?；钚澡b定實驗表明Pseudomonas屬菌株具有較強的抑菌活性。近年來對于Pseudomonas菌株產(chǎn)生活性物質(zhì)的研究已有若干報道，例如溫露等[11]對海洋細(xì)菌Pseudomonassp.的次級代謝產(chǎn)物進行了研究，從其中分離到一個藍(lán)色素，生物活性試驗顯示該藍(lán)色素,對腫瘤細(xì)胞生長有很強的抑制作用。漆淑華等[12]根據(jù)活性追蹤從海洋細(xì)菌Pseudomonassp. 發(fā)酵液中分離到4個環(huán)二肽，可抑制多種能誘導(dǎo)海洋生物幼蟲附著的細(xì)菌的生長。

11株P(guān)seudomonas活性菌株中，除菌株BN05-S-2外，其余10株菌株均成功擴增出NRPS基因片段。經(jīng)BLAST比對與系統(tǒng)發(fā)育樹分析可見，本研究所得到的12條NRPS片段均屬于NRPS的A結(jié)構(gòu)域，表明NRPS基因在Pseudomonas中廣泛存在。在16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹中進化關(guān)系較近的11W、LX-4、2-Z18、83-1等菌株的NRPS 基因的A結(jié)構(gòu)域并不在一個分支上，遺傳距離較遠(yuǎn)，由此證明了它們可能并非同一株菌，同時也證明了得到的NRPS基因片段的多樣性[13]。值得指出的是，從菌株C-1和P499均成功擴增出2條NRPS基因片段，分別為NRP17/NRP19和NRP4995/NRP4998。從同一菌株中擴增出2條NRPS A域片段，且均分別不在一個系統(tǒng)發(fā)育分支上；BLAST結(jié)果和氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹均說明從同一菌株中擴增出的2條A域片段相似度較低，這也從另一方面證明了NRPS基因的多樣性。董曉毅等[14]針對我國東海海域不同生境樣品進行I型PKS基因篩選實驗中也從同一株菌中擴增到2條相似度較低的基因片段，這可能是由于設(shè)計的簡并引物特異性較低導(dǎo)致，但具體原因未見報道。

5株P(guān)seudomonas活性菌株C-1、P499、83-1、P406和205均成功擴增出PKS KS結(jié)構(gòu)域片段，由系統(tǒng)發(fā)育樹可以推斷這5條PKS片段均屬于trans-AT型。PKS I型基因通常合成一些活性物質(zhì)尤其是具有抑菌活性的化合物或抗生素的前體，在生物防御中扮演著重要角色。在本研究中獲得PKS基因的5株菌對尖孢鐮刀菌均表現(xiàn)出較強的抑菌活性，也進一步說明從這些菌群里發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生新型活性化合物的活性菌株的可能性。1993年從Bacillussubtilis168的基因組測序中第一次發(fā)現(xiàn)trans-AT型PKS以來，越來越多的trans-AT型PKS被發(fā)現(xiàn)，一些重要的藥用化合物，如莫匹羅星，卡蘭殺菌素，苔蘚抑素A，和維吉霉素M等都被證實是由trans-AT型PKS產(chǎn)生[15]。

近年來已有若干對Pseudomonas菌株功能基因的研究報道，例如：Philippe等[16]對從植物根部分離的Pseudomonasbrassicacearum進行PKS基因的克隆與序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株含有?；D(zhuǎn)移酶基因與大環(huán)酯類流出蛋白基因，這兩種蛋白基因都屬于PKS基因；劉雙霜等[17]針對NRPS的Amp-binding 腺苷化結(jié)構(gòu)域編碼基因設(shè)計引物，對從中國舟山海域海水篩選的嗜鹽假單胞菌進行PCR擴增，結(jié)果18株假單胞菌中有8株菌株擴增到目的片段；Mossialos等[18]也從Pseudomonasfluorescens擴增出NRPS基因目的片段。目前，針對極地細(xì)菌次級代謝產(chǎn)物合成功能基因如PKS與NRPS的研究尚未見報道。

目前對于PKS和NRPS基因多樣性的研究也有若干報道，不同生境微生物中PKS和NRPS基因具有豐富的多樣性，已有對海綿、總草苔蟲等海洋無脊椎動物，陸地土壤、南極土壤、紅樹林植物根際土壤[19]等環(huán)境樣品中微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性的報道。Ginolhac等[20]研究發(fā)現(xiàn)海洋沉積物中微生物種類繁多，不同環(huán)境的海洋沉積物中可能蘊含著豐富的新型PKS功能基因；董曉毅等[14]從東海洋山港沿岸土壤、海水及海底沉積物等不同生境中獲得了23條PKS片段，說明不同生境中PKS基因的多樣性；朱文勇等[21]通過PCR篩選，從云南大學(xué)的喜樹內(nèi)生放線菌中檢測到了PKSI、PKSII、和NRPS基因，陽性率分別為31.1%，48.9%和45.6%。

極地適冷菌中PKS和NRPS基因的發(fā)現(xiàn)，為活性代謝產(chǎn)物的來源進一步提供了證據(jù)。菌株C-1和P499中2種NRPS基因片段的發(fā)現(xiàn)，意味著其中的代謝產(chǎn)物可能更加豐富?；赑KS和NRPS基因的多樣性和新穎性，可以指導(dǎo)篩選具有藥用價值的新化合物合成能力的活性菌，因此菌株C-1、P499、83-1、P406和205值得進一步深入研究。PKS和NRPS可以合成抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤等多種活性物質(zhì)，對分離到的具有抗菌活性的菌株進行進一步的基因克隆，或許可以從分子生物學(xué)的角度來分析、闡述和推測菌株具有的生物活性物質(zhì)的天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型和合成機理[2]，這也是今后筆者研究的重要方向。

[1] DEMAIN A L, SANCHEZ S. Microbial drug discovery: 80 years of progress[J]. Journal of Antibiotics, 2009, 62(1): 5-16.

[2] ZHU P, ZHENG L, LIN J, et al. Screening and characterization of marine bacteria with antibacterial and cytotoxic activitives, and existence of PKS Ⅰ and NRPS genes in bioactive strains[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2007, 47(2): 228-234. 朱鵬, 鄭立, 林晶, 等. 抗菌和細(xì)胞毒活性海洋細(xì)菌的篩選及其次生代謝基因證據(jù)[J]. 微生物學(xué)報, 2007, 47(2): 228-234.

[3] JIAO Y L, WANG L H, DONG X Y, et al. Isolation and partial characterization of new PKS gene clusters[J]. Chinese Journal of Antibiotics, 2008, 33(3): 134-139. 焦豫良, 王良華, 董曉毅, 等. 新型聚酮合酶基因簇的分離與部分鑒定[J]. 中國抗生素雜志, 2008,33(3):134-139.

[4] KONRAD U F, TOBIAS D, CHRISTOPHER J C, et al. A computational screen for type Ⅰ polyketide synthases in metagenomics shotgun data[J]. PublicLibrary of Science One, 2008, 3(10): e3515.

[5] MING Z H, PAN J W, ZHU M Y. Progress in nonribosomal peptide synthetases[J]. Progress Biochemical Biophysical, 2002, 29(5): 667-669. 明鎮(zhèn)寰, 潘建偉, 朱睦元. 非核糖體多肽合成酶研究進展[J].生物化學(xué)與生物物理進展, 2002, 29(5): 667-669.

[6] ZHENG Z M, GU X B, YU H Q, et al. Advances in main domains of nonribosomal peptide synthetases[J]. Chinese Journal of Antibiotics. 2005, 30 (2): 120-124. 鄭宗明, 顧曉波, 俞海清, 等. 非核糖體肽合成酶主要結(jié)構(gòu)域的研究進展[J]. 中國抗生素雜志,2005,30(2):120-124.

[7] CROSA J H, WALSH C T. Genetics and assembly line enzymology of siderophore biosynthesis in bacteria[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2002, 66(2): 223.

[8] WANG S Y. Advances in the study of the mechanism and application of nonribosomal peptide synthetases[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2007, 47(4): 734-737. 王世媛. 非核糖體肽合成酶(NRPSs)作用機理與應(yīng)用的研究進展[J]. 微生物學(xué)報, 2007, 47(4): 734-737.

[9] WANG H M, HE P Q, LIN X Z, et al. Screening of antarctic bacteria with antifungal activity againstFusariumoxysporumand growth characteristics ofPsychrobactersp. P4-11-07-1[J]. Advances in Marine Science, 2012, 30(1): 102-110. 王紅梅, 何培青, 林學(xué)政, 等. 抑制尖刀鐮孢菌(Fusariumoxysporum)南極細(xì)菌的篩選Psychrobactersp.P4-11-07-1的生長特性[J]. 海洋科學(xué)進展, 2012, 30(1): 102-110.

[10] PIEL J. Biosynthesis of polyketides by trans-AT polyketide synthases[J]. Natural Product Reports, 2010, 27 (7):996-1047.

[11] WEN L, YUAN B H, LI H J, et al. A blue pigment isolated from marine bacteriaPseudomonassp.[J]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni, 2005, 44(4):63-69. 溫露, 袁保紅, 李厚金, 等. 南海海洋細(xì)菌Pseudomonas sp.產(chǎn)生的一種抗腫瘤藍(lán)色素[J]. 中山大學(xué)學(xué)報, 2005, 44(4):63-69.

[12] QI S H, QIAN P Y, ZHANG C. Antibacterial Metabolites from Marine BacteriumPseudomonassp.[J]. Natural Product Research and Development, 2009, 21:420-423. 漆淑華, 錢培元, 張促. 海洋細(xì)菌Pseudomonassp. 抗菌代謝產(chǎn)物的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2009, 21:420-423.

[13] ZHANG W. Screening and diversity revelation of PKS and NRPS gene in sponge associated microbes[D]. Shanghai:Shanghai Jiao Tong University, 2008. 張薇, 海綿共附生活性菌PKS和NRPS基因的篩選及多樣性研究[D].上海：上海交通大學(xué)，2008.

[14] DONG X Y. Screening and identification of Marine microorganisms type I PKS gene[D]. Shanghai: The Second Military Medical Universit, 2007. 董曉毅, 海洋微生物Ⅰ型PKS基因資源的篩選與鑒定[D]. 上海：第二軍醫(yī)大學(xué), 2007.

[15] PIEL J. Biosynthesis of polyketides by trans-AT polyketide synthases[J]. Natural Product Reports, 2010, 27(7): 996-1047.

[16] ORTET P, BARAKAT M, LALAOUNA D, et al. Complete genome sequence of a beneficial plant root-associated bacterium, Pseudomonas brassicacearum [J]. Jouranl of Bacteriology, 2011, 93(2): 3146-3149.

[17] LIU S S, SHAO Z Y, CHEN T, et al. Analysis of bacteriaHalomonascommunity composition of sea waters around Zhoushan Archipelago Sea Area[J]. Food and Drug, 2011, 13(1):9-13.劉雙霜, 邵志宇, 陳婷, 等. 中國舟山海域海水嗜鹽假單胞菌多樣性分析[J]. 食品與藥品，2011, 13(1):9-13.

[18] MOSSIALOS D, OCHSNER U, BAYSSE C, et al. Identification of new, conserved, non-ribosomal peptide synthetases from pseudomonas fluorescent involved in the biosynthesis of the siderophore pyoverdine [J]. Molecular Microbiology, 2002, 45(6): 1673-1685.

[19] MA M, TANG M, HONG K. Detection of type I and II polyketide synthase genes in microorganisms from mangrove rhizosphere soil[J]. Institute of Microbiology, 2013, 40(7): 1231-1240. 馬敏, 唐敏, 洪葵. 四種紅樹植物根際土壤微生物Ⅰ型和Ⅱ型PKS基因的檢測與多樣性分析[J]. 微生物學(xué)通報, 2013, 40(7): 1231-1240.

[20] AURELIEN G, CYRILLE J, BENJAMIN G, et al. Phylogenetic analysis of polyketide synthase I domains from soil metage-nomic libraries allows selection of promising clones[J]. American Society for Microbiology, 2004, 70(9): 5522-5527.

[21] ZHU W Y, LI J, ZHAO G Z, et al. Diversity and antimicrobial activities of endophytic actinomycetes isolated fromCamptothecaacuminataDecne.[J]. Institute of Microbiology, 2010,37(2): 211-216. 朱文勇, 李潔, 趙國振, 等. 喜樹內(nèi)生放線菌多樣性及抗菌活性評價[J]. 微生物學(xué)通報, 2010,37(2): 211-216.

CloningandAnalysisofPKSandNRPSGenesFromPolarBacteriaWithAntifungalActivityAgainstPlantPathogenicFungi

PENG Yu-jiao1,2,3, LI Jing-long1, LIN Xue-zheng2,3*

(1.CollegeofFoodandBiologicalEngineering,QiluUniversityofTechnology, Jinan 250353, China; 2.TheFirstInstituteofOceanography,SOA, Qingdao 266061, China; 3.KeyLaboratoryofMarineBioactiveSubstances,SOA, Qingdao 266061,China)

The antifungal activity against plant pathogenic fungiFusariumoxysporumof 38 strains of polar bacteria was validated by method of agar diffusion. The results showed that 13 strains had obvious antimicrobial activity. Molecular identification and phylogenetic analysis on the basis of 16S rRNA gene indicated that 11 strains belonged to genus ofPseudomonasand 2 strains belonged to genus ofPsychrobacterandArthrobacterrespectively. The PKS and NRPS genes of these antifungal strains were also cloned and analyzed, which might be responsible for biosynthesis of bioactive secondary metabolites. The 12 gene fragments of the domain A of NRPS and the domain KS of type I PKS were cloned from 10 and 5 antifungal strains, respectively. This paper provides a genetic evidence for deeply study these antifungal strains in which the PKS and NRPS biosynthetic pathways may applied.

Polar bacteria; antimicrobial activity; PKS; NRPS

September 13, 2013

2013-09-13

海洋公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目——深遠(yuǎn)海(極地)微生物生物農(nóng)藥的研制與中試示范 (201005032-2)

彭玉嬌(1989-)，女，山東青島人，碩士，主要從事極端環(huán)境微生物方面研究. E-mail：pengyujiao12@163.com

*通訊作者，E-mail：linxz@fio.org.cn

(王佳實 編輯)

Q939

A

1671-6647(2014)03-0396-09