王宇濤， 陳志勇， 曾琬淋， 李韶山

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省高等學(xué)校生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631)

鎘(Cd)是一種具有很高生物毒性的重金屬元素，也是造成我國(guó)農(nóng)田土壤重金屬污染的主要元素之一[1].高等植物雖然可以耐受一定濃度的Cd脅迫[2]，但過(guò)量的Cd會(huì)通過(guò)損傷植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)、抑制細(xì)胞分裂、破壞酶活等方式直接或間接抑制植物的生理過(guò)程，最終抑制植物生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致植物死亡[2].Cd能夠通過(guò)食物鏈的富集危害人體健康[3]，因此闡明Cd 對(duì)植物的毒害及其耐性機(jī)理對(duì)于指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境治理及生態(tài)保護(hù)都具有重要意義.

擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)是廣泛應(yīng)用于植物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)研究的模式植物.已有的研究[4-5]表明，Cd脅迫會(huì)導(dǎo)致擬南芥體內(nèi)ROS積累，進(jìn)而損傷擬南芥的光合系統(tǒng)，并導(dǎo)致其生長(zhǎng)受阻.Cd還能使擬南芥體內(nèi)在電子轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用的金屬蛋白質(zhì)發(fā)生毒化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂類(lèi)及其它生物分子發(fā)生非特異性破壞[5-6].在遭受Cd脅迫時(shí)，擬南芥會(huì)通過(guò)自噬以及增強(qiáng)病原蛋白相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)提高其對(duì)Cd的耐(抗)性[6].總體上，目前關(guān)于擬南芥對(duì)Cd脅迫的耐受機(jī)制以及Cd脅迫引起擬南芥細(xì)胞死亡的機(jī)制尚不清楚[4,6].本文通過(guò)研究擬南芥在不同Cd濃度下的生理響應(yīng)探討Cd的毒性效應(yīng)以及擬南芥的耐性機(jī)理，為深入研究Cd對(duì)植物毒害的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

實(shí)驗(yàn)所用擬南芥為哥倫比亞野生型(ArabidopsisthalianaL. Heynh., Col-0).擬南芥種子經(jīng)次氯酸鈉溶液消毒后播種于含1.5%蔗糖和0.8%瓊脂的1/2 MS培養(yǎng)基(pH 5.8)，垂直培養(yǎng).MS培養(yǎng)基中提前添加CdCl2，使Cd2+濃度分別為0、20、40、60和80 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)置3皿(每皿種植25株擬南芥)作為重復(fù).培養(yǎng)皿放置于擬南芥培養(yǎng)室，培養(yǎng)室溫度為22 ℃，光周期為16 h光照/ 8 h黑暗，光照強(qiáng)度為200 μmol/(m2·s).種植時(shí)間為14 d.

1.2 指標(biāo)測(cè)定與分析

采取烘干稱(chēng)質(zhì)量法測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)皿中擬南芥幼苗的總生物量，并計(jì)算各皿中擬南芥的單株生物量.采取拍照—Image J軟件計(jì)算的方法測(cè)定根長(zhǎng).根部形態(tài)觀察：輕輕鑷取處理14 d的擬南芥幼苗根部，置于玻片上.滴加0.1% evans blue將根部浸沒(méi)，避光染色30 min，滴加去離子水將染料沖洗干凈，晾干后于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照.葉片葉綠素用體積分?jǐn)?shù)80%丙酮提取，然后用分光光度法測(cè)定，計(jì)算總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b以及類(lèi)胡蘿卜素的含量.擬南芥植株的可溶性蛋白、丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定按照李合生[7]的方法. 植物根細(xì)胞DNA損傷的檢測(cè)采用單細(xì)胞凝膠電泳法，通過(guò)測(cè)定嘧啶二聚體的累積量來(lái)表征DNA損傷程度，具體步驟參考文獻(xiàn)[8-9].總酚含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[10].類(lèi)黃酮及花色素苷含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[11].酸溶性硫醇鹽、谷胱甘肽及植物螯合肽(PC)含量的測(cè)定參考王業(yè)社等[12]提供的方法.

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003軟件和SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理，采用最小顯著差法(LSD)檢驗(yàn)不同處理之間的差異顯著性及處理效應(yīng).采用Origin 7.5軟件完成作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd2+對(duì)擬南芥幼苗生長(zhǎng)的影響

Cd2+處理明顯抑制了擬南芥根的生長(zhǎng)以及生物量的積累，隨著Cd2+濃度的增加抑制作用明顯增強(qiáng)(圖1).在20 μmol/L的Cd處理下，生長(zhǎng)14 d擬南芥幼苗的根長(zhǎng)和生物量均極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，表明已經(jīng)對(duì)擬南芥的生長(zhǎng)產(chǎn)生了明顯的脅迫效應(yīng).此外，在80 μmol/L的Cd2+濃度下擬南芥種子的萌發(fā)明顯推遲，表明高濃度Cd2+處理能夠抑制擬南芥種子的萌發(fā).

Cd2+脅迫抑制了擬南芥根的生長(zhǎng)，使根部形態(tài)發(fā)生明顯改變(圖2).未經(jīng)Cd2+脅迫的幼苗根部的根毛稀疏且較短.隨著Cd2+處理濃度增加，幼苗葉片根毛明顯變得長(zhǎng)而致密.

2.2 Cd2+對(duì)擬南芥光合色素含量的影響

Cd2+處理明顯降低了擬南芥幼苗的葉綠素a、葉綠素b以及類(lèi)胡蘿卜素的含量，隨著Cd2+濃度的增加抑制逐漸增強(qiáng)(圖3).高濃度Cd2+處理下(60和80 μmol/L)，擬南芥葉片的葉綠素a、葉綠素b以及類(lèi)胡蘿卜素含量均顯著低于對(duì)照(P<0.05).

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3；圖B中**表示在0.01檢驗(yàn)水平差異顯著；圖C中不同字母表示在0.05檢驗(yàn)水平差異顯著.

2.3 Cd2+對(duì)擬南芥幼苗可溶性蛋白、丙二醛以及抗氧化酶的影響

隨著Cd2+濃度的增加，擬南芥幼苗的可溶性蛋白以及丙二醛含量也逐漸上升(圖4).在40 μmol/L及以上的Cd2+濃度處理下，擬南芥體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量要顯著高于對(duì)照組(P<0.05).在60 μmol/L、80 μmol/L的高Cd2+濃度處理下，體內(nèi)丙二醛含量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，表明高濃度的Cd2+處理對(duì)擬南芥產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化損傷.

隨著Cd2+濃度的增加，擬南芥幼苗過(guò)氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性均逐漸下降(圖5).在所有的Cd濃度處理下，擬南芥幼苗的POD與SOD活性均極顯著的低于對(duì)照組(P<0.01)，表明在本研究中設(shè)置的Cd2+濃度下，擬南芥的抗氧化系統(tǒng)已經(jīng)受到損傷.

2.4 Cd2+對(duì)擬南芥幼苗根部DNA損傷的影響

與對(duì)照相比，隨著Cd2+處理濃度的增加，擬南芥幼苗根部DNA經(jīng)電泳后的拖尾變長(zhǎng)(圖6A).當(dāng)Cd2+處理濃度達(dá)60、80 μmol/L時(shí)，擬南芥幼苗根部DNA出現(xiàn)明顯的降解現(xiàn)象.定量計(jì)算的結(jié)果表明，擬南芥中嘧啶二聚體的累積量隨著Cd2+處理濃度的增加而顯著上升(P<0.01).尤其是在Cd2+濃度達(dá)60、80 μmol/L時(shí)，嘧啶二聚體累積量急速增加(圖6B).

2.5 Cd2+對(duì)擬南芥幼苗次生代謝物的影響

擬南芥體內(nèi)的總酚、類(lèi)黃酮以及花色素苷的含量均隨著培養(yǎng)基中Cd2+濃度的增加逐漸上升(圖7).80 μmol/L的Cd2+處理，使擬南芥體內(nèi)的總酚及類(lèi)黃酮含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05).在20 μmol/L及以上的Cd2+濃度處理下，擬南芥體內(nèi)的花色素苷含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05).

圖2 不同Cd2+濃度處理對(duì)擬南芥根部形態(tài)的影響

擬南芥體內(nèi)的酸溶性硫醇鹽、谷胱甘肽和植物螯合肽的含量均隨著培養(yǎng)基中Cd2+濃度的增加而顯著上升(圖8).在20 μmol/L及以上的Cd2+濃度處理下，擬南芥體內(nèi)的酸溶性硫醇鹽、谷胱甘肽和植物螯合肽含量均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01).

3 討論

Cd是植物的非必需元素.土壤或水體中過(guò)量的Cd被植物吸收后會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生一系列的毒害作用.本研究中，擬南芥在Cd2+處理下葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素含量均顯著下降(P<0.05)，且Cd濃度越高光合色素的含量越低，表明本研究的Cd2+處理對(duì)擬南芥體內(nèi)的葉綠體結(jié)構(gòu)造成了損傷.不少研究也報(bào)道，植物在Cd脅迫下葉綠素含量減少，使得PSⅡ活性和光合磷酸化作用明顯受到抑制[13].這可能是由于Cd抑制了原葉綠素酸酯還原酶的活性，并影響了氨基-γ-酮戊二酸的合成[14].

A：葉綠素a;B：葉綠素b;C：葉綠素a+b;D：類(lèi)胡蘿卜素

圖4 不同Cd2+濃度處理下擬南芥體內(nèi)可溶性蛋白(A)和丙二醛(B)的含量

圖5 不同Cd2+濃度處理下擬南芥體內(nèi)過(guò)氧化物酶(A)和超氧化物岐化酶(B)的活性

A：彗星檢測(cè)圖片，B：將彗星電泳圖片轉(zhuǎn)換成Olive Tail Moment (OTM)值代表嘧啶二聚體的積累量

正常條件下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡.受Cd脅迫后，平衡被破壞，導(dǎo)致活性氧大量積累，從而激活植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，誘導(dǎo)抗氧化酶活性發(fā)生改變[15-16].丙二醛是Cd脅迫下植物體內(nèi)活性氧類(lèi)物質(zhì)大量積累所造成的膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物之一.在本研究中，受Cd脅迫后擬南芥幼苗的丙二醛含量顯著上升，表明擬南芥體內(nèi)積累的活性氧自由基導(dǎo)致了膜脂過(guò)氧化.在相對(duì)較低Cd濃度下，植物通過(guò)提高抗氧化酶的活性來(lái)降低體內(nèi)的過(guò)氧化自由基；但是過(guò)高濃度的Cd2+下則會(huì)與抗氧化酶的巰基結(jié)合，導(dǎo)致酶的催化中心或酶結(jié)構(gòu)受損，造成其活性的降低[16].本研究中，20 μmol/L及其以上的Cd2+處理使擬南芥幼苗的SOD和POD酶活性顯著降低，表明該Cd2+濃度已經(jīng)超過(guò)了擬南芥抗氧化酶的防御能力，進(jìn)而對(duì)擬南芥抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生了損傷.

有研究發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫能夠引起植物根尖細(xì)胞加速老化、核仁受損，從而影響基因組模板的穩(wěn)定性，并使DNA合成受阻[17].張旭紅等[18]發(fā)現(xiàn)Cd誘導(dǎo)蠶豆葉片DNA發(fā)生損傷，在高濃度下甚至導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂.本實(shí)驗(yàn)利用一種檢測(cè)重金屬污染對(duì)植物遺傳效應(yīng)的快速而敏感的彗星檢測(cè)方法[8]發(fā)現(xiàn)，Cd2+脅迫能夠顯著誘導(dǎo)擬南芥根部細(xì)胞的DNA損傷為重金屬脅迫導(dǎo)致植物細(xì)胞DNA損傷的直接證據(jù).其作用機(jī)制可能是Cd2+通過(guò)氧化導(dǎo)致DNA損傷[19]，改變堿基配對(duì)、破壞糖殘基, 最終導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)破壞、鏈斷裂.

圖7 不同Cd2+濃度對(duì)擬南芥體內(nèi)總酚(A)、類(lèi)黃酮(B)以及花色素苷(C)的影響

圖8 不同Cd2+濃度對(duì)擬南芥體內(nèi)酸溶性硫醇鹽(A)、谷胱甘肽(B)和植物螯合肽(C)的影響

大量研究表明，重金屬能夠影響植物的生長(zhǎng)，尤其是根的生長(zhǎng)，其作用機(jī)理主要包括抑制植物根尖細(xì)胞的分裂或根的伸長(zhǎng)、影響植物激素的分布或細(xì)胞死亡等[20].在本研究設(shè)置的Cd濃度明顯抑制擬南芥根的伸長(zhǎng)、生物量積累顯著下降.類(lèi)似的結(jié)果在其它植物(如玉米、大豆、番茄等)中已有不少報(bào)道[21].值得注意的是，受Cd脅迫后擬南芥根的伸長(zhǎng)受到明顯抑制，但是根毛卻比對(duì)照組更長(zhǎng)而致密.類(lèi)似的結(jié)果在另外2種擬南芥屬植物(Arabidopsisarenosa和Arabidopsishalleri)中也有報(bào)道[22].這一現(xiàn)象可能是擬南芥在重金屬脅迫下對(duì)根長(zhǎng)受到抑制的一種補(bǔ)償效應(yīng)：它們通過(guò)分化出更致密、更長(zhǎng)的側(cè)根來(lái)確保能夠從環(huán)境中吸取生長(zhǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)；這種補(bǔ)償效應(yīng)對(duì)于植物在重金屬脅迫下的存活可能至關(guān)重要[18].

酚類(lèi)化合物在植物抗(耐)重金屬方面的效應(yīng)在近年來(lái)受到不少學(xué)者的關(guān)注[23].已經(jīng)報(bào)道Ni、Al、Cd等重金屬脅迫下小麥、玉米、菜豆等植物體內(nèi)酚類(lèi)物質(zhì)含量的明顯升高[24-25].酚類(lèi)化合物通常通過(guò)螯合重金屬離子以及抑制產(chǎn)生ROS的Fenton反應(yīng)來(lái)提高植物的抗氧化能力[23].目前研究最多的酚類(lèi)化合物是類(lèi)黃酮，它在植物與環(huán)境的相互作用中起重要作用[25].研究表明，類(lèi)黃酮與細(xì)胞膜中的膜磷脂相互作用能夠阻止毒性小分子進(jìn)入到磷脂雙分子層的疏水區(qū)域，進(jìn)而保護(hù)植物細(xì)胞膜的完整性[23].此外，類(lèi)黃酮獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)還使得它們能夠直接清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基[23].花色素苷能夠?yàn)橹参锏墓夂掀鞴偬峁氨Ｗo(hù)罩”，以防止強(qiáng)光造成的光合機(jī)構(gòu)損傷[26]；它們還能夠清除H2O2、O2-·、·OH等活性氧分子，其抗氧化能力約為α-生育酚和抗壞血酸的4倍[27].已知花色素苷抗氧化的一條重要途徑是阻止活性氧在胞間連絲間的傳播，防止細(xì)胞中產(chǎn)生的活性氧向其他細(xì)胞擴(kuò)散[28].Hatier等[29]推測(cè)，花色素苷可能與活性氧信號(hào)傳遞途徑的下游第二信使之間也存在著交互作用.在本實(shí)驗(yàn)中，受Cd脅迫后擬南芥的總酚、類(lèi)黃酮、花色素苷的含量均呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)，進(jìn)一步證明了酚類(lèi)物質(zhì)(尤其是類(lèi)黃酮和花色素苷)在擬南芥對(duì)Cd的耐(抗)性方面發(fā)揮了重要作用.

植物對(duì)重金屬的耐性與其體內(nèi)巰基以及谷胱甘肽含量密切相關(guān)[30].本研究中酸溶性巰基和谷胱甘肽含量均隨著Cd濃度的增加而顯著上升，表明它們與在擬南芥抗Cd毒害過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用.其作用機(jī)制可能主要包括與Cd結(jié)合形成金屬硫蛋白以及作為抗氧化劑清除擬南芥體內(nèi)的活性氧自由基[30].植物螯合肽(phytochelations, PC)是由植物螯合肽合酶催化谷胱甘肽合成的一類(lèi)生物小分子，在真菌與高等植物耐受重金屬脅迫機(jī)制中起重要作用[31].不過(guò)有研究者認(rèn)為，PC主要在非重金屬耐性植物中發(fā)揮作用，而在超積累植物耐受重金屬過(guò)程中并不重要[32].本研究中，擬南芥受Cd處理后植物螯合肽的含量迅速上升，且Cd2+處理的濃度越大，擬南芥幼苗中的PC含量越高，表明PC在擬南芥抵御Cd毒害作用過(guò)程中發(fā)揮重要作用.PC的這種作用可能是通過(guò)絡(luò)合Cd2+，并將其轉(zhuǎn)入到擬南芥的液泡中進(jìn)行區(qū)室化保護(hù)[33].

綜上所述，在不同濃度Cd2+處理下，擬南芥體內(nèi)積累了較高濃度具有抗氧化活性的酚類(lèi)物質(zhì)(包括類(lèi)黃酮和花色素苷等)以及能夠抵御Cd毒害的谷胱甘肽和植物螯合肽.這些物質(zhì)通過(guò)與螯合Cd2+、清除活性氧自由基等方式提高了擬南芥對(duì)Cd的耐受性.另一方面，本研究中設(shè)置的Cd濃度對(duì)擬南芥的生理活動(dòng)產(chǎn)生了嚴(yán)重的脅迫效應(yīng)，導(dǎo)致其體內(nèi)活性氧自由基的積累.這些活性氧一方面造成植物細(xì)胞膜損傷、DNA損傷，另一方面還破壞了植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)以及光合系統(tǒng)，并嚴(yán)重抑制了植物主根的生長(zhǎng)以及生物量的積累.

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