李祥高，吳 憲，王世榮

(天津大學化工學院，天津300072)

1 前 言

IUPAC (國際純粹與應(yīng)用化學聯(lián)合會)對生物傳感器的定義是：生物傳感器是一個獨立的集成器件，能夠使用生物識別元素(生化受體)在空間上與傳感器直接接觸，從而提供定量或半定量的分析信息[1]?；瘜W分析法由于其操作復雜、周期長，不能滿足各種實際應(yīng)用需要。20世紀60年代，由于酶分析法的專一性強、靈敏度高、操作方便等優(yōu)點開始取代一些化學分析方法。1962年Clark教授首次提出了酶傳感器的概念，1975年Springs Instruments 制作了第一批商業(yè)化的生物傳感器[2]。傳統(tǒng)酶電極的制作方法繁瑣、成本昂貴、不適宜大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。1984年，英國學者Cass 等人[3]建立了介體酶電極方法，以戊二醛為化學介體取代分子氧作為酶促反應(yīng)的電子受體，以此為基礎(chǔ)，1987年美國MediSene公司開發(fā)出印刷酶電極，用于血糖檢測。這標志著電子印刷技術(shù)應(yīng)用于規(guī)模生產(chǎn)生物傳感器成為可能。

生物傳感器逐步應(yīng)用于我們生活的許多領(lǐng)域，包括發(fā)酵工程、醫(yī)學診斷、制藥工程、食品工程、環(huán)境監(jiān)測等。對生物傳感器的制作工藝也進行了更為廣泛的探索，其中印刷電子技術(shù)被認為是工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)生物傳感器的優(yōu)選技術(shù)路線之一。目前，約50%的一次性葡萄糖傳感器采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)生產(chǎn)[4]。表1列出了葡萄糖傳感器的幾種不同制備工藝。由表1可見噴墨和絲網(wǎng)印刷技術(shù)都可用于制備靈敏度高、檢測限低、線性范圍寬的傳感器。

圖1是近20年來有關(guān)研究印刷電子技術(shù)制作生物傳感器發(fā)表的SCI收錄論文數(shù)量。在2005年以后，尤其是絲網(wǎng)印刷技術(shù)應(yīng)用于生物傳感器制備的研究呈快速發(fā)展態(tài)勢，而噴墨印刷技術(shù)的應(yīng)用則相對緩慢，這是由于噴墨印刷技術(shù)對功能油墨的性能要求很高，其技術(shù)特點更適于個性、現(xiàn)場和小批量的制作。

表1 不同工藝制作的葡萄糖生物傳感器

圖1 SCI收錄的有關(guān)電子印刷制作生物傳感器的論文數(shù)量與年份的關(guān)系曲線Fig.1 Relationship curves between electrically printed biosensor article number included in SCI and years

2 生物傳感器的結(jié)構(gòu)及工作原理

生物傳感器由3部分組成：能與目標分析物形成敏感和特定交互作用的受體；用于檢測和量化目標分析物和受體特殊相互作用的換能器；用于連接受體和換能器的界面層[9]。依據(jù)不同的技術(shù)方法可以對生物傳感器進行不同分類。依據(jù)生物傳感器的結(jié)構(gòu)不同，可以將生物傳感器主要分為電化學生物傳感器和半導體生物傳感器。用于檢測H2O2的電化學生物傳感器通過將酶固定在金屬電極上制作而成，結(jié)構(gòu)示意如圖2[10]。用于檢測蛋白質(zhì)的半導體生物傳感器的結(jié)構(gòu)示意和實物照片如圖3[11]。電化學生物傳感器和半導體生物傳感器的區(qū)別是，前者通過在導電電極基底上進行生物識別組分的修飾制作而成，后者則是通過在場效應(yīng)晶體管基底上修飾生物識別組分制作而成。

圖2 電化學生物傳感器結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Schematic diagram of electrochemical biosensor

圖3 半導體生物傳感器結(jié)構(gòu)示意圖和實物照片F(xiàn)ig.3 Structural schematic diagram and object photos for semiconductor biosensor

生物傳感器的傳感機理是基于生物識別組分和目標分子之間相互作用時電荷轉(zhuǎn)移實現(xiàn)的。轉(zhuǎn)移的電荷會通過導電介質(zhì)傳輸?shù)綋Q能器并被轉(zhuǎn)換為可以識別的信號，從而進行定量或半定量的檢測。通過不同濃度目標分子和所對應(yīng)的信息的關(guān)系，計算模擬出濃度和輸出信息(如電流、電壓、電阻等)之間的代數(shù)關(guān)系式，從而實現(xiàn)對未知濃度目標分子的檢測。

3 印刷電子制作生物傳感器使用的油墨

利用印刷技術(shù)制作生物傳感器的一個重要內(nèi)容是研究導電油墨，以便在基底上通過印刷形成電極，進而生成具有信號響應(yīng)性的功能層。油墨的組成也是決定傳感器性能的一個重要因素，如油墨復合材料的種類(如石墨納米粒子、碳納米管、金納米粒子)、裝載方式，印刷工藝和固化條件等，都會強烈地影響電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)和電極整體分析的結(jié)果和性能[12]。介體物質(zhì)的加入，如鐵藍[12-13]、鐵氰化物[14]、綠膿菌素[15]、酞菁鈷[16]、甲基紫羅堿[17]等能在生物活性材料和目標分子作用的過程中起到類似放大器的作用，從而提高生物傳感器的性能，其作用原理如圖4[18]。用酶作為生物活性材料時，如脫氫酶會需要輔酶或輔基，若從酶蛋白中移除輔助成分，則酶會失去催化活性。

圖4 Prussian Blue(鐵藍)作為中介物生物傳感器傳感機理Fig.4 Sensing mechanism of prussian Blueas as mediator in biosensor

含碳油墨由導電性優(yōu)異的碳黑或石墨(碳納米管)、反應(yīng)活性物質(zhì)、分散介質(zhì)及其添加劑組成，目前主要是研究適合絲網(wǎng)印刷的油墨。制作絲網(wǎng)印刷石墨電極(SPCE)時，需要在油墨中加入聚合物膠黏劑提高成膜性和附著力；用溶劑調(diào)節(jié)粘度以適應(yīng)印刷和控制電極厚度等。目前多使用含碳導電性油墨印刷制作工作電極和對電極。表2是一些典型的SPCE電極用作生物傳感器的例子。

表2 SPCE用作生物傳感器實例

納米粒子復合油墨納米粒子常作為電極的修飾材料，用于生物傳感器中形成良好的固-固界面接觸。基于納米材料修飾的傳感技術(shù)可以提高響應(yīng)靈敏度，通過在場效應(yīng)晶體管上的集成，實現(xiàn)非破壞方式的無標記、實時檢測[22]。粒子的性質(zhì)依賴于粒子的大小、粒子的間距、有機保護殼的性質(zhì)、粒子的形狀等[23]。

表3給出了以Cu、碳納米管、聚合物等修飾的生物傳感器的典型例子。最近幾年研究的熱點之一是利用導電聚合物PEDOT(聚3,4-二氧乙撐噻吩)制備電極。通過在聚合物中摻雜如石墨烯[30]、金納米粒子[31]等能顯著地提高電極的靈敏度。這是由于PEDOT本身具有良好的導電性，再與這些導電粒子形成復合物后進一步改善了導電能力，等效于擴大了電極的有效表面積，增加了與目標分子接觸的機會。Michal Wagner等人[32]將乙二醇、季銨鹽、PEDOT和聚苯乙烯磺酸鹽(PSS)組成的油墨用噴墨印刷的方式覆蓋在玻碳電極表面，在水中浸泡60 d后，電極表面仍能保持良好的吸附性。另外，磁性納米粒子也是近年研究的熱門領(lǐng)域。通過多種磁性納米粒子的同時修飾還可以實現(xiàn)一種電極對多種物質(zhì)的檢測。Longinotti等人將有催化活性的酶固定在超順磁的氧化鐵納米粒子上，通過磁場的作用實現(xiàn)將活性酶吸附或移出電極表面，實現(xiàn)了一個工作電極對多種物質(zhì)的檢測[33]。Bettazzi等人通過將包覆酶的磁性粒子吸附在絲網(wǎng)印刷的電極陣列表面，實現(xiàn)了同時檢測8個樣品，可以顯著降低分析時間[34]。

表3 納米粒子修飾的生物傳感器

Ag/AgCl油墨常用作參比電極的有Ag/AgC電極、飽和甘汞電極和標準氫電極。只有Ag/AgCI電極適于絲網(wǎng)印刷制作。因此，Ag/AgCI油墨常作為三電極體系中參比電極的印刷油墨。

4 印刷電子技術(shù)在生物傳感器方面的應(yīng)用

絲網(wǎng)印刷是印刷電子技術(shù)制作生物傳感器的成功范例，是商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)一次性電極的最主要技術(shù)。絲網(wǎng)印刷電極(SPEs)具有制作成本低、操作簡單、生產(chǎn)速度快等特點[35]。根據(jù)絲網(wǎng)印刷機結(jié)構(gòu)的不同，分平床型、間歇滾筒型和旋轉(zhuǎn)型，決定一個傳感器性能的通常是使用的油墨，不同結(jié)構(gòu)的傳感器使用的油墨有很大的區(qū)別。

4.1 絲網(wǎng)印刷設(shè)備的結(jié)構(gòu)及工作原理

絲網(wǎng)印刷的工藝過程如圖5所示[36]。將加載在圖形化的網(wǎng)版上的油墨用刮板刮過，油墨就會被涂覆到基底上沒有被絲網(wǎng)覆蓋的部分，然后對已涂在基底上的油墨進行熱處理固化，就完成了一次絲網(wǎng)印刷的過程。絲網(wǎng)是決定印刷電極的形狀、厚度的主要因素，油墨品質(zhì)會影響印刷薄膜的均勻性，從而對傳感器性能產(chǎn)生影響。由于生物識別組分通常是酶、抗體、DNA等具有生物活性的物質(zhì)，對溫度比較敏感，在較高的溫度下會失去活性，所以熱處理的溫度和生物識別組分的耐熱性決定了生物識別組分連接到導電物上的溫度要合適。

圖5 絲網(wǎng)印刷過程示意圖Fig.5 Schematic diagram of screen printing process

4.2 絲網(wǎng)印刷技術(shù)在生物傳感器方面的應(yīng)用

4.2.1 電化學生物傳感器

電化學生物傳感器是以電化學傳感器作為基礎(chǔ)電極與生物活性材料作用組成的生物傳感器，簡稱生物電極。通常是用導電油墨采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)制得基礎(chǔ)電極，然后再與生物活性材料如酶、抗體、DNA、RNA等結(jié)合制成生物傳感器。也可以用直接混合生物活性材料與油墨的方式、通過絲網(wǎng)印刷制備傳感器，用于環(huán)境和食品分析[37]。

常見的電化學生物傳感器包括工作電極、對電極和參比電極三電極體系。三電極體系的器件成本較低，且設(shè)計過程簡單，但是電流會改變所包含的化學物質(zhì)的活性而改變參比電極電壓[38]。

4.2.2 半導體生物傳感器

半導體生物傳感器又稱作生物場效應(yīng)晶體管。絲網(wǎng)印刷制作的生物場效應(yīng)晶體管具有高靈敏性、優(yōu)異的生物相容性和靈活性等優(yōu)點，是理想的高性能一次性生物傳感器[39]。但是其結(jié)構(gòu)尺寸通常較小，印刷難度較大，目前印刷電子技術(shù)在這種生物傳感器制作方面的研究報道較少，但這是一類很有發(fā)展前景的傳感器。

4.3 噴墨印刷技術(shù)在生物傳感器方面的應(yīng)用

噴墨印刷是一種非接觸印刷，對基底材料的要求相對較低。噴墨印刷的優(yōu)點是電極制作過程無需制版，可以通過計算機精確控制來印刷復雜圖案的電極，具有成本低、制作簡便、分辨率高、快速、重現(xiàn)性好、靈活、無觸點、廢墨量少等優(yōu)點[40]。與絲網(wǎng)印刷技術(shù)相比，噴墨印刷可以精確地控制電極涂層的厚度、選擇電極構(gòu)型的自由度大、更可以制作個性化圖案的印刷電極。缺點是制作大面積電極沒有優(yōu)勢。Petri Ihalainen等[41]研究了噴墨印刷技術(shù)在普通紙上印刷Au電極，在電極表面形成生物組分識別層，成功制備了紙基生物傳感器。Weng等人[42]通過噴墨印刷在電極表面沉積PPy(聚吡咯)納米粒子和選擇透過性乙基纖維素薄膜保護層對電極進一步優(yōu)化，在4 ℃下干燥貯藏30 d后仍能保持初始靈敏度的90%以上。

噴墨印刷最突出的優(yōu)點是油墨的利用率高。因此，在傳感器的基礎(chǔ)研究和原型器件制作階段，采用噴墨印刷技術(shù)是合適的，尤其是油墨成本高時噴墨印刷技術(shù)制備傳感器就更具有優(yōu)勢。

4.4 其他電子印刷技術(shù)在生物傳感器方面的應(yīng)用

其他可用于生物傳感器制作的印刷技術(shù)還包括微接觸印刷(Micro-Contact Printing)和卷對卷印刷技術(shù)(Roll-to-Roll Printing)。微接觸印刷快速簡單且操作條件要求不苛刻，但是印刷的尺寸較小，油墨的擴散對印刷電極的質(zhì)量影響很大。卷對卷印刷包括柔性版印刷、凹版印刷和納米壓印。

4.4.1 微接觸印刷技術(shù)

微接觸印刷技術(shù)是先通過光學或電子束光刻得到電極模板，壓模材料的化學前體在模板中固化，聚合成型后從模板中脫離，便得到了微接觸印刷所要求的壓模，常用材料是PDMS(聚二甲基硅氧烷)。微接觸印刷是制作微型生物傳感器的一種有效印刷技術(shù)，工作原理如圖6所示[43]。Volcke等人[44]在生物傳感器的制作過程中采用微接觸印刷技術(shù)可方便的將蛋白質(zhì)從Si表面轉(zhuǎn)移到玻璃或聚合物的表面。

圖6 使用PDMS印章功能化納米機電系統(tǒng)的過程Fig.6 Process of functionalized with PDMS stamp nano-electromechanical systems

4.4.2 卷對卷印刷技術(shù)

卷對卷印刷技術(shù)是將滾輪圓周表面上的特征形狀直接壓印在軟板的表面。其優(yōu)點是將微電極直接在軟板上壓印成型，因此不會造成油墨的浪費。但是在壓印滾輪的圓周表面加工微特征形狀的電極模板非常困難，因此不適合制作具有很復雜形狀的電極。

RoieYerushalmi 等人[45]報道了適用于剛性或柔性基底的納米線的大面積印刷技術(shù)，并開發(fā)了以此技術(shù)在柔性基底上制作納米線晶體管的方法。Reddy等人[46]采用凹版印刷技術(shù)在PET基底上印刷含Ag納米粒子油墨制得了線寬200 μm的電極，并制作了相應(yīng)的生物傳感器。

圖7[47]是卷對卷式的凹版印刷(Gravure)、柔性版印刷(Flexographic)、納米壓印(Nanoimprint)的印刷過程示意圖。

圖7 卷對卷式的凹版印刷、柔性版印刷、納米壓印過程示意圖Fig.7 Schematic diagram of gravure printing, flexographic printing, nanoimprint process for roll-to-roll type

5 結(jié) 語

隨著人們對生活質(zhì)量和生命健康的日益關(guān)注，環(huán)境、衛(wèi)生、食品等安全問題越來越受到重視。生物傳感器將在這些領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用，具有良好的市場前景[48]。生物傳感器正快速向微型化、多功能化和低成本化的方向發(fā)展，因此，全絲網(wǎng)印刷制作生物傳感器的實現(xiàn)為生物傳感器的自動化生產(chǎn)開辟了新的途徑。同時，無線傳感器和無線網(wǎng)絡(luò)工程的提出為生物傳感器的發(fā)展開拓了新的方向。

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