彭昌能 李國慶 谷 苗

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國胃癌的發(fā)病率居消化道惡性腫瘤的第1位。在胃癌患者的化療中，適量聯(lián)合使用藥物，通過協(xié)同效應(yīng)作用于腫瘤細(xì)胞，減少其臨床用藥劑量，降低其毒不良反應(yīng)，一直是腫瘤藥物治療的研究熱點(diǎn)之一。

大量的體內(nèi)外研究表明，維生素D3抑制胃癌等多種腫瘤的機(jī)制可能包括以下幾個(gè)方面:①通過抑制β－鈣黏蛋白(β－catenin)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，上調(diào) P21、P27蛋白的表達(dá)從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化及抗增殖［1］;②下調(diào)Bcl－2和Bcl－x1的表達(dá)，從而上調(diào)前凋亡蛋白Bax和Bak的表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其中Bcl－2在維生素D誘導(dǎo)凋亡中起核心作用［2］;③通過上調(diào)PTEN基因表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［3］。環(huán)氧合酶－2(cyclooxygenase－2，COX－2)被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要的相關(guān)性，因而備受關(guān)注［4，5］。COX－2并不直接參與腫瘤的形成，而是通過其催化產(chǎn)物經(jīng)多種途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Greenspan等［6］在體外研究選擇性COX－2抑制劑對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)COX－2的表達(dá)的同時(shí)Bcl－2的表達(dá)也上調(diào)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖并抑制凋亡。Liu等［7］研究顯示COX－2表達(dá)增高可引起B(yǎng)cl－2過表達(dá)，降低E－鈣黏蛋白活性，抑制細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致胃腸道腫瘤的發(fā)生。本研究通過胃癌細(xì)胞體外培養(yǎng)，初步探討1，25－二羥維生素D3與特異性COX－2抑制劑塞來昔布對(duì)胃癌的增殖及凋亡的影響，以及影響凋亡的可能機(jī)制，為1，25－二羥維生素D3和塞萊昔布應(yīng)用于臨床奠定理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1.主要試劑:1，25－二羥維生素 D3購自 Sigma公司;CELE購自大連輝瑞制藥有限公司;Bcl－2、Bax鼠單抗購自福州邁新公司;羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋公司產(chǎn)品;吖啶橙購自福州邁新公司。

2.細(xì)胞株:人胃癌細(xì)胞株SGC－7901購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心，本實(shí)驗(yàn)室保存，按細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)方法培養(yǎng)。

3.方法:(1)經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)MTT法檢測(cè)VitD3和CELE聯(lián)用對(duì)SGC－7901細(xì)胞增殖的抑制作用，筆者選擇了1×10－7mol/L VitD3、2×10－5mol/LCELE單用或聯(lián)用作用于 SGC－7901細(xì)胞，用于實(shí)驗(yàn)研究(細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查、Western blot)。實(shí)驗(yàn)分組:①對(duì)照組;②VitD3組;③CELE組;④VitD3組+CELE組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別加入終濃度為1×10－7mol/L VitD3、2×10－5mol/LCELE 單用或聯(lián)用，無血清培養(yǎng) 24、48、72h，對(duì)照組不加藥。(2)光鏡下細(xì)胞形態(tài)的觀察:細(xì)胞接種于6孔板中，觀察單藥組(2×10－5mol/LCELE 組、10－7mol/L VitD3組)，聯(lián)合組(10－7mol/L VitD3+2×10－5mol/LCELE組)處理細(xì)胞48h后，倒置顯微鏡下用100×攝片，觀察各組細(xì)胞形態(tài)。(3)熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的凋亡:收集以單藥組(2×10－5mol/LCELE 組、10－7mol/L VitD3組)，聯(lián)合組(10－7mol/L VitD3+2×10－5mol/LCELE組)處理細(xì)胞48h后，吖啶橙溶液染色，在熒光顯微鏡下用400×攝片，觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)。(4)Western blot法分析 Bcl－2、Bax蛋白:用 Western blot分析了 SGC－7901細(xì)胞經(jīng)2×10－5mol/L CELE、1×10－7mol/L VitD3單獨(dú)及聯(lián)合作用處理48h后Bcl－2、Bax蛋白的表達(dá)情況(實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)。對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行不同處理并收集各個(gè)處理組細(xì)胞，按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行Western blot，檢測(cè)不同處理組Bcl－2、Bax蛋白的表達(dá)情況。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法采用單因素方差(ANOVA)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.光鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察:由圖1可以看出未含藥物的對(duì)照組處理的細(xì)胞輪廓清晰，可見細(xì)胞貼壁生長、連接緊密、活力旺盛，未見懸浮細(xì)胞。經(jīng)10－7mol/L VitD3組、2 ×10－5mol/L CELE 組、10－7mol/L VitD3+2×10－5mol/LCELE聯(lián)合組處理胃癌細(xì)胞SGC－7901 48h后，可見細(xì)胞體積縮小，貼壁生長的細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞間可見拉絲現(xiàn)象，可見部分懸浮的細(xì)胞，在10－7VitD3+2×10－5mol/L CELE 聯(lián)合組處理的細(xì)胞大都脫落，懸浮于培養(yǎng)液中，而且細(xì)胞數(shù)量明顯減少，幾乎不見貼壁生長的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果從形態(tài)學(xué)上證實(shí)VitD3+CELE聯(lián)合組對(duì)SGC7901細(xì)胞的生長抑制明顯。

圖1 倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察(×100)

2.熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡:從實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖片(圖2)可以看出對(duì)照組的細(xì)胞核完整，染色質(zhì)著綠色，經(jīng) 10－7mmol/L VitD3組、2 × 10－5mmol/LCELE組、10－7mmol/L VitD3+2 ×10－5mmol/L CELE 作用48h后可見凋亡細(xì)胞，形態(tài)不整變形的細(xì)胞，染色加深不均勻，細(xì)胞體積縮小，核染色質(zhì)著橘黃色，可見部分碎裂的細(xì)胞以及凋亡小體，而經(jīng)聯(lián)合組(10－7mmol/L VitD3+2×10－5mmol/L CELE)處理的細(xì)胞則可以看到明顯的凋亡小體及細(xì)胞碎裂，從形態(tài)學(xué)上證實(shí)VitD3、CELE、VitD3聯(lián)合CELE誘導(dǎo) SGC7901細(xì)胞凋亡的作用。

圖2 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡(×400)

3.VitD3、CELE單獨(dú)及聯(lián)合對(duì)SGC－7901細(xì)胞中Bcl－2、Bax蛋白表達(dá)的影響:讀取各實(shí)驗(yàn)組Bcl－2、Bax和β－actin的灰度比值，以 Bcl－2、Bax與 βactin的灰度比值進(jìn)行相對(duì)半定量分析(圖3、圖4)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示VitD3、CELE單獨(dú)及聯(lián)合對(duì)SGC－7901細(xì)胞處理48h后，細(xì)胞中Bcl－2蛋白的表達(dá)明顯減弱，Bax蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)，Bcl－2/Bax的蛋白比值降低，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，聯(lián)合用藥組與各單用藥組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05)。

圖3 VitD3、CELE單獨(dú)及聯(lián)合對(duì)SGC－7901細(xì)胞中Bcl－2、Bax蛋白表達(dá)的影響

圖4 VitD3、CELE單獨(dú)及聯(lián)合對(duì)SGC－7901細(xì)胞中Bax/Bcl－2蛋白比值表達(dá)的影響

討 論

各種環(huán)境因素(包括生理的或者病理的)刺激細(xì)胞時(shí)均可能誘發(fā)細(xì)胞凋亡，與細(xì)胞壞死不同，它是細(xì)胞生理性死亡形式，在非鄰近細(xì)胞間發(fā)生，通常不伴有炎癥，凋亡的細(xì)胞在形態(tài)上表現(xiàn)為核濃縮、染色體斷裂、細(xì)胞體積縮小、以及出現(xiàn)凋亡小體，最后凋亡小體被吞噬細(xì)胞清除。細(xì)胞增生與細(xì)胞凋亡是兩個(gè)相反的生理過程。在正常情況下，兩者都有嚴(yán)密的調(diào)控機(jī)制，以保證胚胎與胎兒發(fā)育，個(gè)體成長及成體中新生的細(xì)胞替代衰老、死亡的細(xì)胞，正常發(fā)育與病理增生、細(xì)胞毒細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的攻擊、以及惡性腫瘤的自發(fā)性退變等［8］。近年來，由于發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系，因而當(dāng)前細(xì)胞生物學(xué)中的關(guān)于細(xì)胞凋亡與腫瘤的研究已經(jīng)成為一個(gè)熱點(diǎn)。

目前，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)細(xì)胞凋亡的手段主要包括細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)觀察和形態(tài)學(xué)特征觀察，它們分別在體外通過定量以及定性兩個(gè)方面對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行研究。細(xì)胞凋亡是最常見及最重要的細(xì)胞生理性死亡類型，在凋亡過程中具有明顯的形態(tài)學(xué)與生化特征［9，10］。其中判定發(fā)生細(xì)胞凋亡的重要依據(jù)之一是通過觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變［11］。筆者采用光鏡(×100)下和熒光顯微鏡(×400)下觀察。光鏡下對(duì)照組的胃癌細(xì)胞貼壁生長良好，呈多角型，細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞間連接緊密，經(jīng)1×10－7mmol/L VitD3作用后，細(xì)胞生長受到抑制，部分細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞中顆粒狀物質(zhì)增多，部分固縮的細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，經(jīng)2×10－5mmol/L CELE作用后，細(xì)胞體積縮小，固縮狀的圓形細(xì)胞明顯增多且可見部分碎裂死亡的細(xì)胞，經(jīng)1×10－7mmol/L VitD3與2×10－5mmol/L CELE 聯(lián)合作用48h后，大量細(xì)胞從瓶壁脫落懸浮與培養(yǎng)液中，幾乎不見正常形態(tài)及貼壁細(xì)胞，多數(shù)為固縮成圓形或者多角形不規(guī)則碎裂死亡的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果從形態(tài)學(xué)上證實(shí)VitD3、CELE對(duì)胃癌細(xì)胞生長均有抑制作用且聯(lián)合用藥作用更為明顯，筆者的實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果與Hehner等［12］的實(shí)驗(yàn)研究相一致。在熒光顯微鏡下觀察，吖啶橙可透過正常細(xì)胞膜，使細(xì)胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光;而在凋亡細(xì)胞中，因染色質(zhì)固縮或斷裂為大小不等的片段，形成凋亡小體。吖啶橙使其染上致密濃染的黃綠色熒光，或黃綠色碎片顆粒;而壞死細(xì)胞黃熒光減弱甚至消失。研究顯示在熒光顯微鏡下，對(duì)照組胃癌細(xì)胞大小一致，細(xì)胞核呈均勻綠色熒光，而經(jīng)VitD3和CELE單獨(dú)及聯(lián)合處理后出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，熒光顯微鏡下表現(xiàn)為細(xì)胞染色不均勻，核呈圓形或者固縮狀、團(tuán)塊狀且核染色明顯增強(qiáng)，可見黃綠色凋亡小體，凋亡小體是有膜包圍的含有核和細(xì)胞質(zhì)碎片的小體，是凋亡細(xì)胞的特征性形態(tài)學(xué)改變［13］。筆者的結(jié)果從形態(tài)學(xué)上證實(shí)了VitD3和CELE對(duì)胃癌細(xì)胞的有誘導(dǎo)凋亡作用，且兩藥聯(lián)合作用更為明顯。

Bcl－2 家族中有促凋亡成員 Bax、Bak、Bid等，還有抗凋亡成員Bcl－2、Bcl－XL等。Bcl－2與 Bax在腫瘤細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用正好相反，Bcl－2的上調(diào)抑制細(xì)胞凋亡，而 Bax的上調(diào)則促進(jìn)凋亡［14，15］。Bax存在細(xì)胞質(zhì)中，它可形成同源二聚體或者與Bcl－2形成異源二聚體。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bcl－2表達(dá)增多時(shí)，可以明顯增多Bcl－2與Bax異源二聚體的形成，則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減弱。而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bax表達(dá)增多時(shí)，可以明顯增加Bax自身形成的同源二聚體，則細(xì)胞凋亡增強(qiáng)。因此Bax/Bcl－2比值是決定細(xì)胞凋亡的重要原因。有大量實(shí)驗(yàn)表明1，25(OH)2D3有加強(qiáng)多種化療藥物抑制腫瘤細(xì)胞增殖以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，并減少后者的不良反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)維生素D能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，且維生素D刺激處理增強(qiáng)HDAC抑制劑如TSA/NaBu以及甲基化酶抑制劑5－Aza誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。也有研究表明VitD3能夠增強(qiáng)COX－2抑制劑抑制乳腺癌、前列腺癌等多種細(xì)胞的增生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。眾多體內(nèi)外研究均已表明COX－2可以增加Bcl－2表達(dá)，減少凋亡，而COX－2選擇性抑制劑塞來昔布可以下調(diào)Bcl－2的表達(dá)促進(jìn)凋亡。但其具體的凋亡機(jī)制尚不明了，為進(jìn)一步探討VitD3聯(lián)合CELE協(xié)同作用的機(jī)制，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)對(duì)照組SGC－7901細(xì)胞和VitD3、CELE單獨(dú)及聯(lián)合處理48h后的SGC－7901細(xì)胞內(nèi)Bcl－2、Bax蛋白表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明顯示，VitD3與CELE能促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，同時(shí)可檢測(cè)到Bcl－2表達(dá)的下調(diào)，Bax表達(dá)的上調(diào)，聯(lián)合用藥組可以更明顯的抑制Bcl－2表達(dá)。因此VitD3聯(lián)合CELE促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的可能作用機(jī)制之一為通過下調(diào)Bcl－2的表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。且兩者聯(lián)用可協(xié)同抑制Bcl－2蛋白表達(dá)，改善Bcl－2/Bax的平衡，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。由此推測(cè)，VitD3、CELE抑制了Bcl－2的活性，而增強(qiáng)了Bax的表達(dá)量，從而兩者聯(lián)用在質(zhì)和量兩方面更加有效地阻斷了Bcl－2抑制胃癌凋亡的作用，改善了Bcl－2/Bax的平衡，從而使兩藥發(fā)揮了協(xié)同效應(yīng)。

由于時(shí)間、經(jīng)費(fèi)和實(shí)驗(yàn)條件的制約，本研究存在一些需要進(jìn)一步完善的地方，VitD3、CELE可協(xié)同促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的作用，其機(jī)制中COX－2、Bcl－2和Bax 3者之間的關(guān)系，可行RT－PCR和Westernblot法做進(jìn)一步的研究。在體內(nèi)兩藥聯(lián)用的最佳作用濃度可行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

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